Цикл трикарбоновых кислот ( цикл Кребса )
Цикл Кребса представляет собой высокоорганизованную циклическую систему взаимных превращений трикарбоновых и дикарбоновых кислот, катализируемую мультиэнзимной ферментной системой, представляющую собой основу клеточного метаболизма. Он функционирует в матриксе митохондрий. Этот метаболический путь назван именем его первооткрывателя, выдающегося биохимика, лауреата Нобелевской премии Ганса Кребса. Последовательность реакций цикла Кребса представлена на нижеследующей схеме. Несмотря на то, что метаболический путь является замкнутым, его началом считается реакция конденсации ацетильного остатка, активаторомпереносчиком которого является КоА, и щавелевоуксусной кислоты (ЩУК или, иначе, оксалоацетат) с образованием цитрата или лимонной кислоты. Эта реакция катализируется ферментов я_цитратсинтазойя. и часто называется цитратсинтазной реакцией.
Cхема реакций цикла Кребса
Далее в ходе двух последовательных реакций цитрат через цисаконитат превращается в изоцитрат. Обе эти реакции: отщепление и присоединение воды катализируется одним и тем же ферментом я_аконитазойя.. Следующая реакция уже носит окислительный характер: изоцитрат подвергается дегидрированию. Отщепленные от изоцитрата атомы водорода переносятся на НАД+ (точнее, на НАД+ переносится гидрид-ион, а протон уходит в окружающую водную фазу). Энергия этого окислительного процесса, а в основном накапливается в виде энергии восстановленного НАДН+Н+. Одновременно с дегидрированием происходит отщепление карбоксильной группы изоцитрата в виде СО2, и трикарбоновая кислота превращается в дикарбоновую 2оксоглутарат. Эта реакция катализируется ферментом я_изоцитратдегидрогеная_зойя..
|
|
|
Образовавшийся 2оксоглутарат на следующем этапе вновь подвергается окислительному декарбоксилированию. Он теряет 2 атома водорода, которые опять же переносятся на НАД+, и от него отщепляется молекула СО2. В результате 2оксуглатарат превращается сукцинилКоА. Это превращение катализируется я_надмолекулярным поя_лиферментным 2оксоглутаратдегидрогеназным комплексомя., в состав которого входят ферменты трех типов, а также 5 кофакторов: НАД+, ФАД, КоА, ТДФ и ЛК. Энергия этого окислительного процесса накапливается, вопервых, в виде энергии восстановленного НАДН+Н+, вовторых, в виде энергии макроэргической связи сукцинилКоА. В следующей реакции, катализируемой я_сукциниля.~я_КоАсинтетазой,я. эта энергия трансформируется в энергию макроэргической связи ГТФ, а сукцинил~КоА превращается в сукцинат.
Далее сукцинат под действием ферментая_ сукцинатдегидрогеназы теряет 2 атома водорода и превращается в фумарат, а два атома водорода вместе с запасом энергии, выделяющейся при окислении, переносятся на ФАД. Фумарат под действиемя_ фумаразыя. присоединяет воду и переходит в малат. Малат, в свою очередь, под действиемя_ мая_латдегидрогеназыя. окисляется путем дегидрирования в щавелевоуксусную кислоту, замыкая тем самым цикл. Отщепленные от малата атомы водорода переносятся на НАД+, в восстановленной форме которого накапливается энергия окисления.
|
|
|
Что же происходит в цикле? Это лучше всего рассмотреть на суммарном уравнении цикла, из которого исключены все промежуточные продукты:
Сравнение левой и правой частей суммарного уравнения показывает, что в ходе одного оборота цикла остаток ацетата расщепляется до 2 СО2, образуется 3 молекулы восстановленного НАД+ и 1 молекула восстановленного ФАД, в которых накапливается энергия окислительных реакций цикла. Кроме того, часть энергии окисления аккумулируется в макроэргической связи ГТФ. Из 250 ккал энергии, выделяющейся при окислении 1 моля ацетила, примерно 200 ккал энергии накапливается, а около 50 ккал переходит в теплоту и рассеивается.
Из уравнения также следует, что в окислительных реакциях цикла не участвует кислород, все они идут путем дегидрирования. Атомы кислорода, необходимые для образования СО2, происходят из молекул воды.
|
|
|
Работа цикла Кребса регулируется с помощью термодинамических и кинетических механизмов контроля. Термодинамические механизмы контролируют направление потока метаболитов в цикле Кребса, тогда как кинетические механизмы ответственны за регуляцию интенсивности потока метаболитов по циклу.
Пусковой реакцией цикла Кребса является цитратсинтазная реакция. Она сопровождается большой потерей свободной реакции (DG= 7,7 ккал/М) и в условиях матрикса митохондрий цитратсинтазная реакция практически необратима, хотя в цитозоле цитрат может превращаться в ацетилКоА и оксалоацетат с использованием энергии АТФ. Большой потерей свободной энергии сопровождается и превращение 2оксоглутарата в сукцинилКоА (DG = 8,0ккал/М), в условиях клетки она абсолютно необратима. Таким образом, за счет включения в систему реакций цикла двух реакций, необратимых в условиях матрикса митохондрий, движение метаболитов в системе возможно только в одном направлении в направлении окисления ацетильных остатков.
Регуляция интенсивности потока метаболитов в цикле выглядит весьма сложно, однако проблема значительно упрощается, если принять во внимание, что одной из главных функций цикла является снабжение клеток энергией. Обеспеченность клетки можно количественно охарактеризовать величиной её энергетического заряда, который определяется по уравнению:
|
|
|
[АТФ] + ½[АДФ]
Эн.З. = [АТФ] + [АДФ] + [АМФ]
Когда клетка хорошо обеспечена энергия, большая часть содержащихся в ней адениновых нуклеотидов находится в виде АТФ и величина энергетического заряда приближается к 1,0, составляя в среднем 0,70,8. Если же клетка потратила большую часть энергии, то значение энергетического потенциала снижается меньше 0,5, и в ней нарастает концентрация АДФ и АМФ. Иначе говоря, высокая концентрация АТФ в клетке это признак её хорошей обеспеченности энергией, а высокая концентрация АДФ и АМФ признак нехватки энергии в клетке. Отсюда, работа цикла Кребса должна тормозиться высокой концентрацией АТФ (энергии в клетке достаточно и целесообразно приберечь «энергетическое топливо») и стимулироваться при повышении в ней концентраций АДФ и АМФ (энергии в клетке нехватает, необходимо включить механизм, обеспечивающий клетку энергией).
Аналогичную роль может играть и соотношение НАДН+Н+/НАД+ в клетке. Высокая концентрация НАДН+Н в клетке свидетельство того, что клетка достаточно хорошо обеспечена энергией, а высокая концентрация НАД+ сигнал о том, что энергия израсходована. В таком случае при высоких концентрациях НАДН+Н работа цикла Кребса должна притормаживаться, тогда как при повышении концентрации НАД+интенсивность потока метаболитов по циклу Кребса должна возрастать.
При рассмотрения вопроса о регуляции работы цикла следует учесть еще одно обстоятельство: промежуточные метаболиты цикла Кребса трикарбоновые и дикарбоновые кислоты являются сильными органическими кислотами и их избыточное накопление в клетке (или в матриксе митохондрий) нежелательно изза угрозы сдвига рН среды в кислую сторону, что может сопровождаться дезорганизацией работы ферментных систем, весьма чувствительных к изменениям водородного показателя.
Кинетический контроль работы цикла осуществляется за счет, вопервых, изменения концентрации субстратов, в особенности за счет изменения концентрации оксалоацетата и ацетилКоА, и, вовторых, за счет изменения активности регуляторных ферментов цикла. К ним относятся цитратсинтаза, изоцитратдегидрогеназа, 2оксоглутаратдегидрогеназный мультиэнзимный комплекс и сукцинатдегидрогеназа.
Скорость потока метаболитов по циклу Кребса, прежде всего, контролируется на его пусковой стадии, т.е. на уровне цитратсинтазной реакции. Этот контроль, вопервых, осуществляется путем изменения концентрации оксалоацетата в клетке и, вовторых, за счет изменения активности цинтратсинтазы, катализирующей эту реакцию. Активность цитрансинтазы по алостерическому механизму угнетается высокими концентрациями АТФ и НАДН+Н+ и сукцинилКоА. Угнетение активности фермента высокими концентрации АТФ и НАДН+Н+ позволяет сберегать»энергетическое топливо» при хорошей обеспеченности клетки энергией, а ингибирующее действие избытка сукцинилКоА направлено на предотвращение накопления в клетке промежуточных продуктов цикла.
Второе регуляторное звено изоцитратдегидрогеназная реакция. Изоцитратдегидрогеназа аллостерически ингибируется высокими концентрациями АТФ и НАДН+Н+, в то время как АДФ является аллостерическим активатором фермента. Кроме того, по некоторым сведениям аллостерическим активатором изоцитратдегидрогеназы является её субстрат изоцитрат.
Третьим пунктом регуляции является 2оксоглутаратдегидрогеназная реакция, причем в регуляции активности 2оксоглутаратдегидрогеназного полиферментного комплекса участвуют 2 механизма: механизм ковалентной модификации и механизм аллостерической модуляции. При высокой концентрации АТФ в клетке идет фосфорилирование комплекса и его активность снижается, причем фосфорилирование стимулируется по аллостерическому механизму высокими концентрациями в клетке АТФ, НАДН+Н+и сукцинилКоА. Дефосфорилирование комплекса, т.е. перевод его в активную форму аллостерически стимулируется повышенными концентрациями АМФ.
И, наконец, активность фермента сукцинатдегидрогеназы, катализирующего превращение сукцината в фумарат, угнетается по механизму конкурентного ингибирования высокими концентрациями малата и оксалоацетата. Это ингибирование направлено на предотвращение избыточного накопления промежуточных продуктов цикла в клетке.
В целом, при повышении концентрации АТФ и НАДН+Н+в клетках интенсивность потока метаболитов в цикле Кребса падает за счет аллостерического ингибирования и негативного эффекта ковалентной модификации; в то время как накопление АДФ и АМФ в клетке стимулирует работу цикла.
2.2.2.Дополнительные аспекты в отношении цикла Кребса
Цикл Кребса выполняет не только энергетическую функцию. Ряд промежуточных продуктов цикла используется в клетках как исходный материал для биосинтезов. В этом состоит пластическая функция цикла. В частности, сукцинилКоА используется при синтезе гема; из оксалоацетата образуется аспарагиновая кислота, а из 2оксоглутарата глутаминовая кислота, причем обе образующиеся аминокислоты сами могут использоваться в различных биосинтезах, например при синтезе нуклеотидов.
Использование промежуточных продуктов цикла для биосинтетических целей приводит к снижению их концентрации в клетках и, как следствие, к торможению работы цикла вплоть до полной дезорганизации процесса. Естественно, в ходе эволюции сформировались механизмы, позволяющие скомпенсировать эту утечку метаболитов за счет их дополнительного синтеза. Их несколько. Повидимому, главным из них является образование оксалоацетата из пирувата:
СН3СОСООН + СО2 + АТФ > СООНСН2СОСООН + АДФ + Ф
Реакция катализируется ферментом я_пируваткарбоксилазойя., аллостерическим активатором которого является ацетилКоА. Отсюда, накопление ацетилКоА в клетке стимулирует синтез оксалоацетата в клетке и создает тем самым условия для его более интенсивного расщепления в цикле Кребса.
Вторым источником метаболитов цикла Кребса являются углеродные скелеты аминокислот, поскольку в основном именно при их распаде во второй фазе катаболизма образуются оксалоацетат, фумарат, сукцинилКоА и 2оксоглутарат, поступающие в третью фазу.
В целом, цикл Кребса является не только метаболическим путем, в котором происходит окончательная деградация углеродных скелетов соединений различных классов до углекислого газа, но и источником пластического материала для синтеза различных соединений, необходимых клетке. В этом состоит огромная интегрирующая функция цикла, связывающего в единую систему обмен соединений различных классов.
1.6.Способы окисления веществ в биологических системах
Различные соединения в клетках могут окисляться тремя способами:
1. Путем отщепления атомов водорода от окисляемого субстрата, иначе говоря, путем дегидрирования.
Принято различать два вида дегидрирования: дегидрирование аэробное и дегидрирование анаэробное. Суть различий сводится к вопросу о первичном акцепторе атомов водорода, отщепляемых от окисляемого субстрата:
если первичным акцептором отщепляемых атомов водорода служит кислород, дегидрирование является аэробным (зависимым от кислорода); если же первичным акцептором отщепляемых атомов водорода служит какоелибо другое соединение, дегидрирование является анаэробным (независимым от кислорода). Примерами таких соединений акцепторов водорода могут служить НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, окисленный глутатион (ГSSГ), дегидроаскорбиновая кислота и др.
2. Путем присоединения к молекулам окисляемого вещества кислорода, т.е. путем оксигенирования.
3. Путем отдачи электронов.
Все живые организмы принято делить на организмы аэробные и организмы анаэробные. Аэробные организмы нуждаются в кислороде, который,вопервых, используется в реакциях оксигенирования, вовторых, служит конечным акцептором атомов водорода, отщепленных от окисляемого субстрата. Причем, около 95% всего поглощаемого кислорода служит конечном акцептором атомов водорода, отщепленных в ходе окисления от различных субстратов, и лишь 5% поглощаемого кислорода участвует в реакциях оксигенации.
Конечным акцептором атомов водорода или электронов у анаэробных организмов служат другие соединения, а источником атом кислорода, появляющихся в составе различных соединений у этих организмов обычно являются молекулы воды. Таким образом, анаэробные организмы не нуждаются в кислороде.
1.7. Особенности процессов окисления в живых системах
Еще Лавуазье в свое время пришел к выводу, что процессы окисления питательных веществ в организме и процессы горения имеют много общего: образуются одинаковые конечные продукты, выделяется одинаковое количество энергии. Поэтому окислительные процессы в организме он назвал «медленным горением», подчеркнув тем самым не только общие черты этих процессов, но и имеющиеся в них различия.
Остановимся подробнее на различиях процессов биологического окисления и окисления в небиологических системах.
Вопервых, конечные продукты окисления далеко не всегда одинаковы. Так, при окислении органических азотсодержащих соединений в клетках процесс не идет до конца и нитраты практически не образуются. В соответствии с этим и количество энергии, выделяющееся при окислении 1 г. белков в организме, составляет 4,1 ккал, тогда как при сжигании того же количества белка в калориметрической бомбе выделяется 5,3 ккал энергии. Вовторых, процессы окисления в клетках идут преимущество путем дегидрирования, тогда как в небиологических системах в присутствии кислорода идет оксигенация.
В третьих, процессы биоокисления идут в мягких условиях: температура 37о, рН около 7,0, давление примерно 760 мм рт. ст., окисление идет в присутствии воды и др. Поэтому для достижения нужной скорости окислительных процессов требуются высокоэффективные катализаторы ферменты.
Все ферменты, участвующие в катализе окислительновосстановительных реакции в организме относятся к классу ОКСИДОРЕДУКТАЗ. В свою очередь, все ферменты этого класса могут быть разделены на 4 группы:
1. Ферменты, катализирующие реакции дегидрирования или дегидрогеназы. В зависимости от характера акцептора отщепляемых от окисляемого субстрата (SH2) атомов водорода различают:
а). Аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие реакции типа:
SH2 + O2 > Sокисл.+ H2O2 б). Анаэробные дегидрогеназы с типовой реакцией:
SH2 + X > Sокисл.+ XH2, где «Х» первичный акцептор атомов водорода, отличный от О2.
2. Ферменты, катализирующие реакции оксигенирования или оксигеназы. В зависимости от того, один атом кислорода из молекулы кислорода присоединяются к окисляемому веществу в ходе реакции или идет присоединение обоих атомов кислорода, все оксигеназы делят на две подгруппы:
а). Монооксигеназы, катализирующие присоединение к субстрату одного атома кислорода из его молекулы. Второй атом кислорода в ходе монооксигеназной реакции идет на окисление второго соединения косубстрата реакции (КоН2):
SH + O2 + KoH2 > SOH + Kоокис. + H2O, тем самым предотвращается появление в клетке крайне агрессивного окислителя атомарного кислорода. Иначе ферменты этой подгруппы называются гидроксилазы.
б). Диоксигеназы, катализирующие присоединение к окисляемому субстрату обоих атомов из молекулы кислорода. В ходе реакций в молекуле окисляемого субстрата появляются дополнительные кислородсодержащие группировки, карбонильные или гидроксильные.
Один из вариантов реакции:
SH2 + O2 > HOSOH Д> S=O + H2O
3. Ферменты, катализирующие отщепление электронов от окисляемых субстратов. Эти ферменты носят название цитохромы. Цитохромы, как правило, содержат геминовые группировки, имеющие в своей структуре атомы железы, способные изменять валентность. Принимая электроны от окисляемого субстраты, атомы железа геминовой группировки восстанавливаются, а затем они окисляются, передавая электроны дальше:
4. К оксидоредуктазам относится также группа вспомогательных ферментов, таких как каталаза или пероксидаза. Они играют защитную роль в клетке, разрушая перекись водорода или органические гидроперекиси, образующиеся в ходе окислительных процессов и представляющие собой достаточно агрессивные соединения, способные повреждать клеточные структуры.
В четвертых, существенной чертой процессов биологического окисления является его многоступенчатый характер. Процесс окислительного расщепления соединения оказывается разделенным на ряд стадий, причем на каждой отдельной стадии выделяется небольшая порция свободной энергии. Такое поэтапное выделение энергии предотвращает тепловое повреждение клеточных структур и создает условия для аккумуляции энергии.
В пятых, важной особенностью процессов биологического окисления является их регулируемый характер, причем реализуется один из основных принципов биоэнергетики интенсивность процессов, поставляющих энергию, контролируется интенсивностью процессов, идущих с потреблением энергии (а не наоборот).
1.7. Функции биологического окисления
Важнейшей функцией биологического окисления, безусловно, является высвобождение энергии, заключенной в химических связях питательных веществ. Выделяющееся энергия используется для осуществления энергозависимых процессов, протекающих в клетках, а также для поержания температуры тела. Однако, это не является единственной функцией биоокисления.
Второй функцией биоокисления является пластическая: в ходе расщепления питательных веществ образуются низкомолекулярные промежуточные продукты, используемые в дальнейшем для биосинтезов. Например, при окислительном распаде глюкозы образуется ацетилКоА, который далее может пойти на синтез холестерола или высших жирных кислот.
Третьей функцией биоокисления является генерация восстановительных потенциалов, которые в дальнейшем используются в восстановительных биосинтезах. Главным источником восстановительных потенциалов в биосинтетических реакциях клеточного метаболизма является НАДФН+Н+, образующийся из НАДФ+ за счет атомов водорода, переносимых на него в ходе некоторых реакций дегидрирования.
Четвертая функция биоокисления участие в процессах детоксикации,т.е. обезвреживания ядовитых соединений или поступающих из внешней среды, или образующихся в организме. В ходе окисления этих соединений изменяется их структура, что приводит к уменьшению их токсичности; кроме того, в соединениях появляются дополнительные полярные группировки (гидроксильные или карбонильные группы), увеличивающие гидрофильность обезвреживаемых соединений, что облегчает их выведение из организма.
2.3.Главная цепь дыхательных ферментов митохондрий
В ходе многочисленных реакций дегидрирования, происходящих как во второй фазе катаболизма, так и в цикле Кребса, образуются восстановленные формы коферментов: НАДН+Н+ и ФАДН2. Эти реакции катализируются многочисленными пиридинзависимыми и флавинзависимыми дегидрогеназами. С четырьмя такими ферментами мы познакомились при рассмотрении работы цикла Кребса, общее же их число в клетке составляет несколько сотен. В то же время пул коферментов в клетке ограничен, поэтому восстановленные формы коферментов должны «разряжаться», т.е. передавать полученные атомы водорода на другие соединения с тем, чтобы в конечном итоге они были переданы у аэробных организмов на свой конечный акцептор кислород. Этот процесс «разрядки» или окисления восстановленных НАДН+Н+ и ФАДН2 выполняет метаболический путь, известный под названием главная цепь дыхательных ферментов. Она локализована во внутренней мембране митохондрий.
Главная цепь дыхательных ферментов (в дальнейшем сокращенно ЦДФ) состоит из 3 сложных надмолекулярнных белковых комплексов, катализирующих последовательную передачу электронов и протонов с восстановленного НАДН+Н на кислород:
Первый надмолекулярный комплекс катализирует перенос 2 электронов и 2 протонов с восстановленного НАДН+Н+на КоQ с образованием восстановленной формы последнего КоQH2. В состав надмолекулярного комплекса входит около 20 полипептидных цепей, в качестве простетических групп некоторых из них входит молекула ФМН и один или несколько так называемых железосерных центров (FeS)n. Электроны и протоны с НАДН+Н+вначале переносятся на ФМН с образованием ФМНН2, затем электроны с ФМНН2 переносятся через железосерные центры на КоQ, после чего к КоQ присоединяются протоны с образованием его восстановленной формы:
Следующий надмолекулярный комплекс комплекс III также состоит из нескольких белков: цитохрома b, белка, имеющего в своем составе железосерный центр и цитохрома С1. В состав любого цитохрома входит геминовая группировка с входящим в неё атомом железа элемента с переменной валентностью, способного и принимать электрон, и отдавать его. Начиная с КоQН2 пути электронов и протонов расходятся. Электроны с КоQН2 передаются по цепи цитохромов, причем одновременно по цепи передается по 1 электрону, а протоны с КоQН2 уходят в окружающую среду.
Цитохром С оксидазный комплекс (комплекс IV) состоит из двух цитохромов: цитохрома а и цитохрома а3. Цитохром а имеет в своем составе геминовую группировку, а цитохром а3 кроме геминовой группировки в своем составе содержит еще и атом Cu. Электрон при участии этого комплекса переносится с цитохрома С на кислород.
НАД+, КоQ и цитохром С не входят в состав ни одного из описанных комплексов. НАД+ служит коллекторомпереносчиком протонов и электронов с большого ряда окисляемых в клетках субстратов. Функцию коллектора электронов и протонов выполняет также КоQ, принимая их с некоторых окисляемых субстратов (например, с сукцината или ацилКоА) и передавая электроны на систему цитохромов с выводом протоны в окружающую среду. Цитохром С также может принимать электроны непосредственно с окисляемых субстратов и передавать их далее на четвертый комплекс ЦДФ.
Так, при окислении сукцината работает сукцинат:КоQоксидаредуктазный комплекс (Комплекс II), передающий протоны и электроны с сукцината непосредственно на КоQ, минуя НАД+:
Для того, чтобы молекула кислорода превратилась в 2 иона О2, на нее должны быть перенесены 4 электрона. Принято считать, что по цепи переносчиков электронов последовательно переносится 4 электрона с двух молекул НАДН+Н+ и до принятия всех четырех электронов молекула кислорода остается связанной в активном центре цитохрома а3. После принятия 4 электронов два иона О2 связывают по два протона каждый, образуя таким образом 2 молекулы воды.
В цепи дыхательных ферментов используется основная масса поступающего в организм кислорода до 95%. Мерой интенсивности процессов аэробного окисления в той или иной ткани служит дыхательный коэффициент (QO2), который обычно выражается в количестве микролитров кислорода, поглощенных тканью за 1 час в расчете на 1 мг сухого веса ткани (мкл.час1.мг1). Для миокарда он равен 5, для ткани надпочечников 10, для ткани коркового вещества почек 23, для печени 17, для кожи 0,8. Поглощение кислорода тканями сопровождается одновременным образованием в них углекислоты и воды. Этот процесс поглощения тканями О2 с одновременным выделением СО2 получил название тканевое дыхание.
3.1.Энергетические аспекты транспорта электронов по цепи дыхательных ферментов
Электроны, а вслед за ними и протоны, движутся по дыхательной цепи от восстановленного НАДН+Н+к кислороду. Что же заставляет их двигаться? Как известно из курса общей химии, каждой паре соединений, состоящей из восстановленной и окисленной формы одного и того же вещества, соответствует определенной значение окислительновосстановительного или редокспотенциала. Так, установлено что пара НАДН+Н+/НАД+имеет значение редокспотенциала, равное 0,32 в, а значение редокспотенциала для пары О / О2 составляет +0,82 в. В таком случае между началом и концом цепи переносчиков электронов, функционирующей в митохондриях, существует разность редокспотенциалов, равная 1,14 в. Эта разность редокспотенциалов и заставляет двигаться электроны по цепи дыхательных ферментов с НАДН+Н+ на кислород.
Движение электронов по градиенту редокспотенциала сопровождается выделением энергии, причем количество выделяющейся энергии можно рассчитать по формуле:
DGo = n.F.DEo, где:
DGo количество выделяющейся свободной энергии; n количество переносимых электронов при окислении того или иного соединения (при расчете выделения свободной энергии в цепи дыхательных ферментов «n» равняется 2);F число Фарадея, равное 23,062 ккал/моль.вольт;DEo значение разности редокспотенциалов между окисляемым веществом и окислителем. Подставив в формулу значение разности редокспотенциалов между началом и концом цепи дыхательных ферментов, мы получим количество выделившейся энергии при окислении 1 моля НАДН+Н+:
DGo = 2. 23,062. 1,14 = 52,6 ккал/моль.
Зная значения редокспотенциалов для каждого из промежуточных переносчиков цепи дыхательных ферментов, можно рассчитать количество энергии, выделяющееся на любом участке дыхательной цепи. Так, значение редокс потенциала для пары КоQ/КоQН2 составляет +0,04 в, а для пары цитохром Свосст./цитохром Сокисл. +0,25 в. Тогда разность редокс потенциалов на уровне I комплекса составит 0,36 в, а количество выделяющейся энергии 16,6 ккал; разность редокспотенциалов на уровне III комплекса составит 0,21 в, а выделение энергии 9,7 ккал; на уровне IV комплекса эти величины составят соответственно 0,57 в и 26,3 ккал.
Остается разрешить один вопрос почему окисляемые субстраты в одних случаях передают свои электроны на НАД+, в других случаях на КоQ, наконец, в третьих случаях на цитохром С. Ответ достаточно прост это зависит от значения редокспотенциала окисляемого субстрата. Если значение редокспотенциала окисляемого субстрата ниже, чем 0,32 в, электроны и протоны с такого субстрата переносятся на НАД+ (изоцитрат, глутамат, малат и др.); если значение его редокспотенциала выше, чем 0,32 в, но ниже 0,04 в, то электроны с этого субстрата переносятся на КоQ (сукцинат, 3фосфоглицерол, ацилКоА и др.); наконец, при значении редокспотенциала окисляемого субстрата выше 0,04 в электроны с него переносятся на цитохром С (аскорбат).
3.2. Окислительное фосфорилирование как механизм аккумуляции энергии биологического окисления
Выделяющаяся в ходе окислительных процессов свободная энергия должна быть аккумулирована в виде энергии макроэргических связей АТФ или родственных ей соединений, поскольку в противном случае она превратиться в теплоту и будет рассеяна в окружающей среде. Синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата с использованием энергии, выделяющейся в ходе окислительных процессов, получил название «окислительное фосфорилирование».
Принято выделять два варианта окислительного фосфорилирования: окислительное фосфорилирование на уровне субстратов или субстратное окислительное фосфорилирование и окислительное фосфорилирование в цепи дыхательных ферментов. Механизмы этих процессов существенно отличаются друг от друга. Принято считать, что за счет окислительного фосфорилирования в цепи дыхательных ферментов в клетке образуется до 90% необходимой ей АТФ и лишь около 10% АТФ синтезируется в ходе субстратного окислительного фосфорилирования
3.2.1. Субстратное окислительное фосфорилирование
Примерами окислительного фосфорилирования на уровне субстрата могут служить два далее приведенных превращения:
При окислительном декарбоксилировании 2оксоглутарата в цикле Кребса на первом этапе энергия окисления накапливается, вопервых, в виде энергии восстановленного НАДН+Н+, вовторых, в виде энергии макроэргической связи продукта окисления сукцинила~КоА. На следующем этапе энергия макроэргической связи сукцинил~КоА трансформируется в энергию макроэргической пирофосфатной связи ГТФ.
На второй схеме представлена часть процесса окислительного расщепления глюкозы. Промежуточный продукт этого метаболического пути 3фосфоглицериновый альдегид подвергается окислению с образованием 1,3 дифосфоглицериновой кислоты, причем энергия окисления накапливается в виде энергии восстановленного НАДН+Н+ и энергии макроэргической связи окисленного субстрата реакции с остатком фосфорной кислоты. На следующем этапе энергия макроэргической связи 1,3дифосфоглицериновой кислоты опять же трансформируется в энергию макроэргической пирофосфатной связи АТФ.
Сравнивая две представленных схемы процессов мы обнаруживаем в них много общего: энергия окисления того или другого субстрата первоначально накапливается в макроэргической связи окисленного субстрата с дополнительной группировкой (КоА или остатком фосфорной кислоты), а затем эта накопленная энергия используется для образования макроэргической пирофосфатной связи ГТФ или АТФ. Таким образом, механизм субстратного окислительного фосфорилирования достаточно хорошо изучен.
3.2.2. Окислительное фосфорилирование в дыхательной цепи
Механизм аккумуляции энергии, выделяющейся в ходе функционирования цепи дыхательных ферментов в митохондриях, менее ясен. Экспериментальным путем установлено, что при переносе пары электронов с НАДН+Н+ на атом кислорода синтезируется максимум 3 молекулы АТФ. Приняв во внимание, что для образования 1 моля пирофосфатных связей АТФ в реакции ее синтеза из АДФ и неорганического фосфата необходимо 7,3 ккал энергии, мы можем рассчитать что из 53 ккал свободной энергии, выделяющейся при окислении 1 моля НАДН+Н+, в клетке аккумулируется примерно 22 ккал.т.е. около 40%. Опытным путем найдено также, что окисление в дыхательной цепи 1 моля ФАДН2 (или же 1 моля КоQH2) сопровождается синтезом 2 молей АТФ, а окисление 1 моля восстановленного цитохрома С образованием 1 моля АТФ. Эти соотношения логически вполне объяснимы меньше выделяется энергии и, соответственно, меньше синтезируется АТФ. Мерой эффективности процесса окислительного фосфорилирования в цепи дыхательных ферментов служит я_коэффициент я.Ря_/я.О количество атомов фосфора, включенных из неорганического фосфата в состав АТФ, в расчете на 1 связанный атом кислорода, пошедший наобразование воды в ходе работы дыхательной цепи. При окислении НАДН+Н+ он равен 3, при окислении ФАДН2(КоQН2) он составляет 2 и при окислении восстановленного цитохрома С он равен 1.
Существует несколько гипотез относительно самого механизма аккумуляции энергии, выделяющейся при движении электронов по цепи дыхательных ферментов, в том числе химическая, конформационная, химиоосмотическая и др.
В основе химической концепции сопряжения лежит представление об образовании в ходе работы дыхательной цепи промежуточных богатых энергией соединений, причем энергия этих промежуточных соединениймакроэргов далее используется для синтеза АТФ. Однако до настоящего времени многочисленные попытки обнаружить подобного рода промежуточные соединениямакроэрги не увенчались успехом.
В основе конформационной гипотезы лежит представление о том, что энергия, выделяющаяся в ходе транспорта электронов по цепи дыхательных ферментов, первоначально накапливается в виде энергии напряженной конформации белков, участвующих в этом процессе, а далее она используется для синтеза АТФ из АДФ и Ф, однако достаточного экспериментального обоснования эта концепция также не имеет.
Наиболее обоснованной на настоящий момент является химиоосмотическая концепция сопряжения, выдвинутая Митчелом. Большой вклад в её разработку и экспериментальное обоснование внесли также такие ученые как Вильямс, Робертсон, В.П.Скулачев. Суть химиоосмотической концепции сопряжения в следующем: свободная энергия, выделяющаяся при движении электронов по цепи дыхательных ферментов, используется для откачки (выброса) протонов «Н+» из внутреннего пространства, т.е. матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану митохондрий в межмембранное пространство. В результате в межмембранном пространстве митохондрий накапливаются протоны, а в матриксе митохондрий накапливаются гидроксилы, т.е. «ОН». Перемещение «Н+» из внутреннего пространства митохондрий в окружающую среду осуществляется за счет анизотропного расположения в мембране митохондрий уже известных нам ферментных комплексов, причем на уровне каждого из 3 комплексов главной дыхательной цепи при прохождении через него пары электронов из внутреннего пространства митохондрий в межмембранное пространство выбрасывается два протона. Сама же внутренняя мембранна непроницаема для протонов, что было однозначно установлено экспериментально.
В результате откачки протонов из матрикса митохондрий в мемжмебранное пространство создается разность электрохимических потенциалов (DmН) относительно внутренней мембраны митохондрий. Она складывается из градиента концентрации протонов (Z DрН) относительно внутренней митохондриальной мембраны снаружи концентрация протонов выше, чем изнутри, и разности электрического заряда (Dj) относительно этой мембраны с наружной стороны мембраны заряд положительный, тогда как изнутри отрицательный.
DmН = Dj + Z DрН
Система, имеющая в своей структуре градиент электрохимического потенциала, является системой, имеющей запас химической энергии. Эта химическая энергия используется в дальнейшем для синтеза АТФ. Трансформация энергии электрохимического градиента в энергию макроэргических связей АТФ осуществляется в ходе работы надмолекулярного белкового комплекса, являющегося структурным компонентом внутренней митохондриальной мембранны. Этот комплекс состоит из двух субъединиц: F0 и F1. Субъединица FО пронизывает внутреннюю митохондриальную мембрану, образуя туннель, через который протоны могут двигаться по градиенту концентрации из межмембранного пространства в матрикс митохондрии. Субъединица F1, состоящая из нескольких полипептидных цепей, прикреплена к субъединице Fo c внутренней стороны мембранны и представляет собой фермент АТФсинтетазу, способную использовать свободную энергию, выделяющуюся при движении протонов по градиенту электрохимического потенциала, для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата.
Сам механизм синтеза АТФ неизвестен. Предполагается, что поступающие по туннелю субъединицы F1 протоны направляются в активный центр АТФсинтетазы, где они отрывают атом кислорода от остатка неорганического фосфата, переводя его в активированное состояние, а затем этот активированный остаток неорганического фосфата взаимодействует с концевым остатком фосфорной кислоты АДФ с формированием макроэргической пирофосфатной связи АТФ:
Таким образом, по Митчелу аккумулирование свободной энергии, выделяющейся в ходе работы цепи дыхательных ферментов, состоит из двух этапов: на первом этапе энергия, выделяющаяся при движении электронов по дыхательной цепи, трансформируется в энергию электрохимического градиента, а на втором этапе энергия электрохимического градиента трансформируется в энергию макроэргических связей АТФ.
В пользу справедливости химиоосмотической концепции сопряжения говорят следующие экспериментально установленные факты:
а. Синтез АТФ в митохондриях возможен только при сохранении целостности их внутренней мембраны. Действительно, если целостность этой мембраны будет нарушена, протоны будут проникать в матрикс митохондрий, минуя АТФсинтетазу, АТФ синтезироваться не будет, а энергия электрохимического градиента будет превращаться в тепловую энергию.
б. Добавление протонов в среду, содержащую митохондрии, сопровождается синтезом в них АТФ. Синтез АТФ в этих условиях идет за счет искусственно создаваемого электрохимического градиента, так как вносимые в среду протоны могут свободно проникать в межмембранное пространство митохондрий, но не проникают в их матрикс.
в. Проведенные количественные исследования показали, что включение 1 атома «Р» в АТФ сопровождается перемещением 2 протонов из межмембранного пространства внутрь митохондрий, что в принципе совпадает с теоретическими положениями химиоосмотической гипотезы. Кроме того, в ходе проведенных исследований было показано, что окисление в митохондриях 1 молекулы сукцината действительно сопровождается выведением в межмембранное пространство митохондрий 4 протонов, а окисление 2оксоглутарата 6 протонов, что и предсказывает обсуждаемая концепция.
В неповрежденных митохондриях процесс движения электронов по дыхательной цепи и процесс синтеза АТФ жестко сопряжены, причем интенсивность потока электронов по дыхательной цепи лимитируется скоростью синтеза АТФ. Это объясняется следующим обстоятельством: за счет синтеза АТФ идет разрядка формируемого работой дыхательной цепи электрохимического градиента; если скорость синтеза АТФ снижается, то величина электрохимического градиента будет постепенно нарастать и в конце концов энергии, выделяющейся при работе дыхательной цепи, будет недостаточно для откачки протонов из матрикса митохондрий против возросшего уровня электрохимического градиента. Торможение выброса протонов приведет к блоку работы ферментных комплексов дыхательной цепи.
Синтезированная в ходе окислительного фосфорилирования АТФ поступает из матрикса митохондрий в цитозоль с помощью специальной транспортной системы, встроенной во внутреннюю мембрану митохондрий. Эта транспортная система переносит молекулу АТФ из матрикса в цитозоль в обмен на молекулу АДФ, перемещаемую в обратном направлении. Поскольку АДФ абсолютно необходима для работы АТФсинтетазы, скорость фосфорилирования, а значит и интенсивность работы дыхательной цепи будет зависеть от концентрации АДФ в матриксе митохондрий.
В условиях покоя в клетке концентрация АДФ в ней низкая, мало АДФ поступает в митохондрии и, соответственно, скорость окисления также будет низкой. И наоборот, в работающей клетке нарастает концентрация АДФ, увеличивается поступление АДФ в митохондрии и ускоряется ход окислительных процессов. Изменение скорости окислительных процессов в митохондриях за счет изменения в них концентрации АДФ является основным механизмом регуляции интенсивности окислительных процессов в митохондриях и известен под названием «дыхательный контроль». Этот механизм лежит в основе реализации одного из основных принципов биоэнергетики скорость окислительных процессов в клетках определяется потребностью клеток в энергии.
3.3. Нарушения работы механизмов окислительного фосфорилирования
3.3.1. Действие ингибиторов цепи дыхательных ферментов
Целый ряд веществ может нарушать работу цепи дыхательных ферментов в митохондриях, блокируя перенос электронов на уровне того или иного ферментного комплекса. Так, ингибитором первого ферментного комплекса являются ротенон или некоторые барбитураты, например, амитал натрия. Ротенон является высоко токсичным соединением, используемым в качестве средства борьбы с сельскохозяйственными вредителями (инсектицид), а барбитураты используются в качестве снотворных, хотя точно неизвестно, связан ли их снотворный эффект с ингибированием работы цепи дыхательных ферментов.
Ингибитором комплекса III является антибиотик антимицин, а цианид и СО являются мощными ингибиторами комплекса IV. Высокая токсичность цианида и антимицина достаточно хорошо известна. Следует лишь обратить внимание на то, что СО вызывает не только нарушение транспорта кислорода кровью за счет образования карбоксигемоглобина, но и нарушает работу цепи дыхательных ферментов, т.е. использование кислорода в клетках.
Наконец, соединение «карбоксин» является ингибитором комплекса II и в этом качестве нарушает окисление в митохондриях сукцината, блокируя тем самым работу цикла Кребса на уровне сукцинатдегидрогеназы.
3.3.2.Разобщение окисления и фосфорилирования
Нарушение целостности внутренней мембраны митохондрий будет сопровождаться нарушением синтеза АТФ, поскольку разрядка электрохимического градиента будет идти в обход системы синтеза АТФ; в то же время работа ферментных комплексов дыхательной цепи будет продолжаться, другими словами, окисление будет идти, тогда как фосфорилирование будет нарушено, частично или полностью. Такое состояние известно под название разобщения окисления и фосфорилирования. Коэффициент Р/О при этом при окислении НАДН+Н+ становится меньше 3 и может принимать любые значения вплоть до 0. Поскольку в неповрежденных митохондриях скорость окисления лимитируется эффективностью работы сопряженного с ним процесса фосфорилирования, то при разобщении скорость окисления в митохондриях возрастает.
Эффект разобщения можно вызвать другим путем достаточно добавить к целым митохондриям вещества, способные связывать протоны на внешней стороне мембраны и переносить их в матрикс. После диссоциации в матриксе соединение в депротонированной форме выходит из митохондрии и может связывать следующий протон, включаясь в новый цикл переноса протонов через внутреннюю мембранну:
Результатом работы такого механизма опятьтаки будет нарушение окислительного фосфорилирования, проявляющееся в снижении синтеза АТФ и в ускорении окислительных процессов в митохондриях. К числу таких соединений, получивших название веществразобщителей, относятся полихлорфенолы и нитрофенолы, используемые в сельском хозяйстве для борьбы с вредителями; к ним относится, например, ацетилсалициловая кислота, используемая в медицине в качестве жаропонижающего средства. Разобщающим эффектом обладают также высшие жирные кислоты в высоких концентрациях. В митохондриях бурой жировой ткани обнаружен специфический белок, получивший название «термогенин», выступающий в качестве проводника протонов через внутреннюю мембрану. Вызываемое с его помощью разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях буровой жировой ткани приводит к увеличению теплопродукции этой тканью, что является ее главной физиологической функцией.
3.4. Гипоэнергетические состояния
Нарушения работы процессов, обеспечивающих клетки энергией, приводит к развитию гипоэнергетических состояний, сопровождающихся нарушениями различных функций клеток. Гипоэнергетические состояния являются основной причины гибели клеток со всеми вытекающими отсюда последствиями. Можно выделить три основных группы причин развития таких состояний: вопервых, недостаток питательных веществ в клетках; вовторых, недостаток окислителя,т.е. кислорода в клетках; в третьих, нарушение клеточных механизмов высвобождения и аккумуляции энергии. В любом случае будет снижаться содержание АТФ и других макроэргов в клетках с нарушением в них различных эндэргонических процессов.
В соответствии с этими тремя группами причин гипоэнергетические состояния делятся на следующие группы:
а). Алиментарные. К ним относятся гипоэнергетические состояния, вызванные недостаточным поступлением в организм питательных веществ или витаминов (В1, В2, В3, В5 и др.)
б). Гипоксические. Они могут быть обусловлены или недостатком кислорода во внешней среде (экзогенные); или нарушением функционирования органов дыхания, например при тяжелой пневмонии (дыхательные); или нарушением транспорта кислорода вследствие расстройства кровообращения (циркуляторные); или снижением содержания гемоглобина в крови, а также нарушением его способности транспортировать кислород, например, при образовании карбоксигемоглобина при отравлении угарным газом (гемические).
в). Гистотоксические. Последние могут быть обусловлены поступлением в клетки или соединений, являющихся ингибиторами работы цепи дыхательных ферментов (ротенон, амитал, антимицин, карбоксин, цианид), или появлением в клетках соединенийразобщителей (полихлорфенолы или нитрофенолы).
Дата добавления: 2015-12-20; просмотров: 47; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!