Перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 4

Результат реакции с изогемагглютинирующими сыворотками группы			Исследуемая кровь принадлежит к группе
0ab (I) (анти-А+В)	Аb(II) (анти-В)	Вa(III) (анти-А)	0ab(I)
- -	- -	- -
Стандартные эритроциты
0(I) -	A(II) +	B(III) +

Результат реакции с изогемагглютинирующими сыворотками группы			Исследуемая кровь принадлежит к группе
0ab (I) (анти-А+В)	Аb(II) (анти-В)	Вa(III) (анти-А)	Ab(II)
+ +	- -	+ +
Стандартные эритроциты
0(I) -	A(II) -	B(III) +
Результат реакции с изогемагглютинирующими сыворотками группы			Исследуемая кровь принадлежит к группе
0ab (I) (анти-А+В)	Аb(II) (анти-В)	Вa(III) (анти-А)	Ba(III)
+ +	+ +	- -
Стандартные эритроциты
0(I) -	A(II) +	B(III) -

Результат реакции с изогемагглютинирующими сыворотками группы				Исследуемая кровь принадлежит к группе
0ab (I) (анти-А+В)	Аb(II) (анти-В)	Вa(III) (анти-А)	АВо(IV) контроль	Исследуемая кровь принадлежит к группе
+ +	+ +	+ +	-	ABo(IV)
Стандартные эритроциты
0(I) -	A(II) -	B(III) -

ПРИЧИНЫ ОШИБОК И МЕРЫ ИХ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ

Отступление от изложенных правил может привести к ошибочному заключению о групповой принадлежности исследуемой крови.

Ошибочное заключение о групповой принадлежности может явиться следствием нарушения:

технических условий проведения реакции;

методических условий проведения реакции;

быть связанной с биологическими особенностями исследуемой крови.

К нарушениям, связанным с техническими сторонами реакции, относятся:

несоблюдение условий взятия крови, доставки проб крови, оформления направления и маркировки пробирки;

перепутывание при вклеивании в медицинскую карту анализов, механические ошибки при переписывании результатов;

ошибочный порядок расположения стандартных сывороток и эритроцитов в штативах и неправильное нанесение их на пластинку;

загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, неправильная маркировка пипеток;

использование недоброкачественных стандартов, например, сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной), загрязненной, помутневшей или частично высохшей, которая может вызвать неспецифическую реакцию агглютинации.

Для предупреждения возможных ошибок такого свойства необходимо в начале работы тщательно проверить расположение в штативах стандартных реагентов, сывороток, эритроцитов, их качество, групповую принадлежность, номер серии, срок годности. Строго соблюдать правила взятия крови, выписки направления, маркировки и доставки проб крови.

Ко второй возможной группе ошибок относятся несоблюдение методики определения группы крови и, как результат, - неправильная оценка реакции как в целом, так и в каждой отдельной капле, заключающаяся в следующем:

лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не произошло, в то время как она фактически должна появиться (ложноотрицательный результат);

лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла агглютинация, в то время как она фактически отсутствует (ложноположительный результат);

Ложноотрицательный результат реакции проявляется при:

несоблюдении времени, необходимого для проведения реакции (5 минут). В случае, если эритроциты исследуемого лица обладают слабой агглютинабильностью, стандартная сыворотка в течение первых минут реакции дает замедленную, нечеткую, слабовыраженную агглютинацию, которая постепенно усиливается только к 5-ой минуте. Наиболее частой ошибкой является невыявление слабой подгруппы А₂В(IV), которую ошибочно относят к В(III), и подгруппы А₂(II), которую ошибочно относят к 0(I) группе;

неправильном соотношении количества сыворотки и эритроцитов. При избытке крови, если взята слишком густая капля крови и не выдержано соотношение крови и сыворотки 1:10;

неполном смешивании сыворотки и эритроцитов (плохо размешана капля, не покачивается пластинка);

нарушении температурного режима реакции (температура ниже +15⁰С и температура выше +25⁰С).

Ложноположительный результат реакции наблюдается при:

неспецифической агглютинации, когда эритроциты исследуемой крови складываются в «монетные столбики», которые невооруженным глазом можно принять за агглютинаты;

при феномене ауто- или панагглютинации, когда исследуемые эритроциты агглютинируются стандартными сыворотками всех групп, включая АВ(IV), а также сывороткой исследуемой крови.

при подсыхании капли, когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не покачивают или удлиняют время наблюдения сверх 5 минут.

В этих случаях необходимо:

провести повторное исследование испытуемой крови перекрестным методом для установления полной формулы крови по системе АВО, заменив стандартные изогемагглютинирующие сыворотки другими сериями;

для исключения неспецифической агглютинации необходимо добавить одну каплю (0,05 мл) изотонического раствора хлорида натрия, во все капли, где произошла агглютинация с последующим покачиванием пластинки;

для исключения феномена ауто- или панагглютинации необходимо отмыть испытуемые эритроциты теплым изотоническим раствором хлорида натрия (температура +37⁰С) путем центрифугирования и повторить реакцию со стандартными сыворотками.

Ошибки, связанные с биологическими особенностями исследуемой крови, могут быть обусловлены наличием слабых антигенов – А₂, В₂, А₂В, АВ₂, экстраагглютининов, панагглютинации, аутоагглютинации, кровяной химеры вследствие гемотрансфузии, ослаблением агглютинабельности эритроцитов при онкопатологии.

В большинстве случаев ошибок при определении групповой принадлежности крови можно избежать путем строгого соблюдения инструкции. При затруднении в определении сложных групп крови образец направляют в региональную ОПК или СПК для исследования специалистом-изосерологом.

Дополнение

В настоящее время, наряду с применением изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО, полученных от доноров крови, используются моноклональные антитела - дополнение 1 (моноклональные реагенты РНПЦГТ, цоликлоны компаний «Гематолог», «Медиклон» и др. производителей), идентификационные карты для определения групп крови АВО в гелевом тесте (ID-карты ДиаМед и др. производителей) – дополнение 2, метод с использованием специальных карточек с высушенными на них тестовыми реактивами (Biotest и других производителей) -дополнение 3, микропланшеты Эритайп с нанесенными моноклональными антисыворотками (компании Biotest AG. Германия и других производителей), карты универсальные серологические (с микроколонками) Сэллбайнд (компании Sanquin Reagents, Голландия и других производителей).

Постановка реакций гемагглютинации с их использованием должна производиться согласно инструкции производителя.

Дополнение 1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ СИСТЕМЫ АВО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ РЕАГЕНТОВ

АНТИ-А, АНТИ-В, АНТИ-АВ

Реагенты анти-А, анти-В, анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации.

Моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ антитела являются продуктом жизнедеятельности специфических мышиных гибридом и принадлежат к иммуноглобулинам класса М.

Определение производится в крови с консервантом, без консерванта, венозной или капиллярной.

На планшет (пластинку) наносят по 1 большой капле (0,1 мл) реагенты анти-А, анти-В, анти-АВ под соответствующими надписями.

Рядом с каплями реагентов наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01-0,03 мл), затем реагент и кровь смешивают и наблюдают за ходом реакции при легком покачивании пластины или планшета в течение 5 минут. Агглютинация эритроцитов обычно наступает в первые 3-5 сек., но наблюдение следует вести 5 мин. ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро склеивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

При положительном результате реакции агглютинации со всеми реагентами необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешивают на плоскости одну каплю физиологического раствора хлорида натрия с одной каплей исследуемых эритроцитов. Заключение о принадлежности исследуемой крови к группе АВ (IV) делают только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.

Учет результатов реакции агглютинации представлен в таблице.

Таблица 3

Интерпретация результатов реакции агглютинации

эритроцитов моноклональными антителами

Результат^* реакции с реагентом			Группа крови АВО
Анти-А	Анти-В	Анти-АВ	Группа крови АВО
-	-	-	O(I)
+	-	+	A(II)
-	+	+	B(III)
+	+	+	AB(IV)

Примечание.

В большинстве случаев при определении групп крови моноклональными реагентами достаточно вести учет реакции по наличию или отсутствию агглютинации с двумя реагентами: анти-А и анти-В.

Дополнительное введение в реакцию реагента анти-АВ необходимо в диагностических лабораториях при возникновении затруднений при определении групп крови.

При получении сомнительного результата определение группы крови АВО проводится с использованием изогемагглютинирующих сывороток от доноров крови или моноклональных антител другого производителя.

__________________________________________________________

* Знаком плюс обозначено наличие агглютинации, знаком минус - отсутствие

Дополнение 2

ПРИМЕНЕНИЕ ИДЕНТИФИКАЦИОННЫХ КАРТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ АВО В ГЕЛЕВОМ ТЕСТЕ МИКРОМЕТОДОМ (ID-КАРТЫ ДИАМЕД)

Идентификационные карты ID-ДиаМед фирмы ДиаМед (Швейцария) предназначены для одновременного определения группы крови АВО и резус-принадлежности в эритроцитах человека. ID-карты ДиаМед можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, моноклональными реагентами анти-А, анти-В, анти-D.

ID-карты ДиаМед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть пробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток, шестая контрольная пробирка содержит нейтральный гель без антител.

Принцип метода основан на разделении эритроцитов при центрифугировании после реакции гемагглютинации в геле. Образующиеся агглютинаты не проходят через гель из-за большого размера и остаются в верхней части пробирки (положительный результат).

При отсутствии антигена в исследуемом образце эритроциты не образуют агглютинатов с антисывороткой, при центрифугировании легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат).

Оборудование и реактивы

ID-центрифуга для центрифугирования карт;

пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,01; 0,05 и 0,5 мл;

штатив для пробирок и карт;

пробирки вместимостью 5 и 10 мл;

раствор для разведения 1 (модифицированный раствор бромелина);

раствор для разведения 2 (модифицированный раствор низкой ионной силы – LISS).

Порядок проведения исследования

Для проведения исследования используют консервированную кровь или кровь, взятую без консерванта.

Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 1, если используются ID-карты, содержащие антитела сыворотки крови человека, для чего:

выдержать раствор для разведения 1 до достижения комнатной температуры (+18⁰ – 25⁰С);

в промаркированной пробирке приготовить 5% взвесь типируемых эритроцитов в растворе для разведения 1, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения 1 и 0,05 мл цельной крови или 0,025 мл эритроцитарной массы;

выдержать пробирку при комнатной температуре (+18⁰ – 25⁰С) в течение 10 минут.

Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 2, если используются ID-карты, содержащие моноклональные антитела, для чего:

выдержать раствор для разведения 2 до достижения комнатной температуры (+18⁰ – 25⁰С);

в промаркированной пробирке приготовить 5% взвесь типируемых эритроцитов в растворе для разведения 2, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения 2 и 0,05 мл цельной крови или 0,025 мл эритроцитарной массы.

С промаркированной ID-карты снять защитную фольгу и внести в каждую пробирку по 0,01 мл исследуемых эритроцитов, приготовленных в растворе для разведения 1, или по 0,0125 мл (12,5 мкл) исследуемых эритроцитов, приготовленных в растворе для разведения 2.

Центрифугировать ID-карты в центрифуге в течение 10 минут.

Оценить результаты исследования (рисунок 1, таблица 4).

Рисунок 1. Оценка результатов реакции агглютинации

в гелевом тесте

Характер агглютинации при выявлении антигенов в гелевом тесте зависит от количества антигенных детерминант, присутствующих на одном эритроците. Образцы эритроцитов с большим количеством антигенных детерминант имеют характер агглютинации 4+, характер агглютинации эритроцитов со слабыми вариантами антигенов соответствует диапазону от 3+ до +.

Таблица 4

Результаты исследования антигенов группы крови АВО и

резус-принадлежности в ID-карте АВО/Rh

Выявляемые антигены					Контроль	Заключение об АВО и резус-принадлежности исследуемого образца крови
А	В	АВ	D	CDE	Контроль
+	+	+	+	+	-	AB Rh+
+	+	+	-	-	-	AB Rh-
+	-	+	+	+	-	A Rh+
+	-	+	-	-	-	A Rh-
-	+	+	+	+	-	B Rh+
-	+	+	-	-	-	B Rh-
-	-	-	+	+	-	O Rh+
-	-	-	-	-	-	O Rh-

Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем ID-карты. При наличии положительных и слабоположительных реакций в контроле необходимо повторить исследование с отмытыми эритроцитами и провести дополнительное исследование по выявлению холодовых и тепловых аутоантител. В случае выявления аутоантител, типирование антигенов эритроцитов проводят после предварительной аутоадсорбции и элюции аутоантител.

Подробная инструкция по применению прилагается к каждому набору идентификационных карт ID-ДиаМед фирмы ДиаМед (Швейцария) или других производителей.

Дополнение 3

ПРИМЕНЕНИЕ КАРТОЧЕК С МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ АВО (СЕРАФОЛ АВО+D)

Карточки с моноклональными антителами Серафол АВО+D фирмы Biotest используются для определения группы крови непосредственно перед трансфузией крови (тест у постели больного). Тест является подтверждением ранее проведенного определения группы крови по системе АВО и D реципиента и гарантирует совместимость группы крови реципиента и крови предназначенной для переливания.

Тест-карта покрыта высушенными специфическими моноклональными реактивами и предназначена для определения группы крови по системе АВО и антигена D системы Резус.

Для проведения исследования можно использовать венозную или капиллярную кровь.

Карточку промаркировать, указав личные данные больного.

Нанести одну каплю физиологического раствора хлорида натрия и одну каплю крови в зоны определения и аутоконтроля (в случае определения венозной крови рекомендуется использовать дозирующую пипетку).

Тщательно смешать кровь с окрашенными высушенными антисыворотками при помощи чистой палочки или обратной стороны пипетки (каждое поле должно быть перемешано до образования гомогенной реакционной массы).

Круговыми движениями карточки в течение 30 секунд добиться перемешивания реакционной смеси и осуществления реакции. Через 60-90 секунд учесть полученный результат (таблица 5) и записать результаты на карту.

Таблица 5

Результаты определения группы крови АВО и

резус-принадлежности с использованием карты Serafol

Анти-А	Анти-В	Анти-D	Аутоконтроль	Группа крови
+	-	+	-	А Rh+
+	-	-	-	A Rh-
-	+	+	-	B Rh+
-	+	-	-	B Rh-
+	+	+	-	АB Rh+
+	+	-	-	AB Rh-
-	-	+	-	O Rh+
-	-	-	-	O Rh-
+	+	+	+	Тест не действителен

Наличие агглютинации – положительная реакция.

Отсутствие агглютинации – отрицательная реакция.

Если в поле аутоконтроля имеются признаки агглютинации, результат является недействительным, и тест должен быть повторен.

После определения группы крови карточку оставляют при комнатной температуре (+18^о-22^оС) до полного высыхания. После высушивания на карточку наклеивается прозрачная самоклеющаяся пленка, после чего она может быть прикреплена в историю болезни.

Дата добавления: 2022-12-03; просмотров: 23; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 34

Мы поможем в написании ваших работ!