Иммунологическое выявление и диагностика
Следует помнить о том, что B. anthracis антигенно очень близкородственна B. cereus, которая является почти повсеместным компонентом микрофлоры окружающей среды. Единственными разными антигенами, по которым можно дифференцировать эти два вида посредством иммунологических методов, являются антигены токсина сибирской язвы, продуцируемые во время экспоненциальной фазы роста, и капсула B. anthracis. Это значительно ограничивает диапазон иммунологических методов, которые можно использовать в методологии рутинного обнаружения.
Тест Ascoli
В 1911 г. Ascoli опубликовал процедуру для обнаружения термостабильных антигенов сибирской язвы в тканях животных, используемых для производства побочных продуктов. В данной процедуре для продуцирования преципитиновой реакции использовалась антисыворотка, полученная в кроликах. Тест не имеет высокой специфичности: термостабильные антигены B. anthracis такие же, как и у других подвидов Bacillus, и зависим от вероятности того, что в животном будет размножаться только B. anthracis, и будет накоплено достаточное количество антигена для получения положительной реакции. В настоящее время данная процедура используется только в Восточной Европе.
Для проведения теста Ascoli положить приблизительно 2 г образца в 5 мл солевого раствора, содержащего уксусную кислоту в конечной концентрации 1/100, и кипятить в течение 5 минут. Полученный раствор охладить и отфильтровать через фильтровальную бумагу. В небольшую тест-пробирку помещают несколько капель кроличьей антисыворотки (приготовление сыворотки описано ниже). Фильтрат из предыдущего этапа осторожно слоем наносят сверху антисыворотки. Положительный тест – это образование видимой полосы преципитина в течение менее чем 15 минут. Следует включать суспензии положительных и отрицательных контрольных образцов.
|
|
|
Антисыворотку получают в кроликах посредством подкожного введения им вакцины Sterne против сибирской язвы в 1-ый и 14-ый дни. На 28-ой и 35-ый дни кроликам вводят
0,5 мл смеси из нескольких штаммов вирулентной B. anthracis, не более 105 колониеобразующих единиц/мл, суспендированных в солевом растворе. Альтернативно, живые вирулентные бактерии можно инактивировать посредством длительного суспендирования в 0,2% формалинизированном физиологическом растворе, но тогда необходимо увеличить массу антигена до 108-109 колониеобразующих единиц/мл. Перед введением животному следует проверить суспензию на инактивацию B. anthracis посредством культивирования 0.1 мл в 100 мл питательного бульона, содержащего 0.1% гистидина, и посредством субкультивирования на кровяном или питательном агаре после инкубации при 37оС в течение 7 дней. Схема введения для обработанной формалином суспензии после первоначальной вакцинации на первый и 14-ый дни – это увеличивающиеся дозы в 0,1, 0,5, 1 и 2 мл, вводимые внутривенно через интервалы в 4-5 дней. После каждой процедуры следует производить тест-отбор крови на 10-ый день после последней инъекции, чтобы определить следует ли вводить дополнительные дозы по 2 мл для повышения преципитинового титра.
|
|
|
Иммунофлуоресценция
Несмотря на то, что в ходе научных исследований были достигнуты некоторые успехи при использовании иммунофлуоресценции для визуализации капсулы (4), данный метод не пригоден для рутинной диагностики.
Подтверждение вирулентности с помощью полимеразной цепной реакции
Окончательное подтверждение вирулентности можно произвести, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Изложенные далее инструкции взяты из ВОЗ (2008). Матричную ДНК для полимеразной цепной реакции можно получить из свежей колонии B. anthracis на питательном агаре посредством ресуспендирования петли, наполненной культурой, в 25 мкл стерильной деинонизированной (или дистиллированной) воды и нагревания до 95оС в течение 20 минут. После охлаждения приблизительно до 4оС и краткого центрифугирования, надосадочную жидкость можно использовать для проведения полимеразной цепной реакции.
|
|
|
В таблице, представленной ниже, указаны праймеры (Beyer et al., 1996; Hutson et al., 1993), подходящие для подтверждения присутствия рХ01 и рХ02 плазмид.
Полимеразную цепную реакцию можно проводить в объемах по 50 мкл, используя указанные выше праймеры, по 200 мкМ каждой из dATP, dCTP, dTTP и dGTP, 1,5 мМ MgCl2 и 2,5 единиц AmpliТaq® полимеразы1, все в NH4 буфере с последующим
1 Этот продукт продается Applied Biosystems;
(https://www.applied biosystems.com)
добавлением 5 мкл матричной ДНК. Выявлено, что работа с этими малыми фрагментами лучше всего протекает при использовании 2% агарозного геля.
Альтернативно, в Pharmacia Biotech2 можно приобрести гранулы Ready-to-GoTM (гранулы готовые к использованию). Эти гранулы представляют собой предварительно смешанные, дозированные, высушенные гранулы, стабильные при комнатной температуре, содержащие все необходимые реагенты, кроме праймера и матрицы, для проведения 25 мкл полимеразных цепных реакций. Матрицу можно добавлять в объеме 2,5 мкл.
2 GE Healthcare https://www.gelifesciences.com
Можно использовать следующий цикл проведения полимеразной цепной реакции: 1 х 95оС в течение 5 минут: 30 х 95оС в течение 0,5 минуты с последующим этапом: 55оС в течение 0,5 минуты, затем - 72оС в течение 0,5 минуты; 1 х 72оС в течение 5 минут, охлаждение до 4оС.
|
|
|
Следует отметить, что праймеры, указанные в таблице выше, давали хорошие результаты в плане подтверждения присутствия или отсутствия рХ01 и/или рХ02 в чистых культурах изолятов от животных (включая человека) или в образцах и пробах из окружающей среды. Но, однако, они не подходят для прямого обнаружения B. anthracis в таких пробах и образцах. Альтернативные варианты можно найти в работах Jackson et al. (1998) и Ramisse et al. (1996). В тех редких случаях, когда изолят может не содержать обе рХ01 и/или рХ02, следует также использовать хромосомный маркер, праймеры для него также указаны в работах Jackson et al. (1998) и Ramisse et al. (1996).
Дата добавления: 2022-06-11; просмотров: 13; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!