Риск зооноза и требования к биобезопасности
ЧАСТЬ 3
_______________________________________________________________
БОЛЕЗНИ, ВХОДЯЩИЕ В СПИСОК МЭБ И ДРУГИЕ БОЛЕЗНИ, ИМЕЮЩИЕ ВАЖНОСТЬ ДЛЯ МЕЖДУНАРОДНОЙ ТОРГОВЛИ
РАЗДЕЛ 3.1.
БОЛЕЗНИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ВСЕХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ
ГЛАВА 3.1.1.
СИБИРСКАЯ ЯЗВА
РЕЗЮМЕ
Определение болезни: Сибирская язва – болезнь, преимущественно, травоядных животных, однако она может поражать всех млекопитающих, включая людей и несколько видов птиц. Смертность, особенно у травоядных, может быть очень высокой. Этиологическим агентом является спорообразующая, грамположительная палочковидная Bacillus anthracis. Болезнь широко распространена в мире и является зоонозом.
Описание болезни: Болезнь опосредуется эндотоксинами. Зарегистрированы молниеносная, острая, подострая и, редко, хроническая формы болезни, При молниеносной и острой формах болезни прижизненные клинические признаки болезни могут фактически отсутствовать. Подострая форма заболевания может сопровождаться прогрессирующей лихорадкой, депрессией, отсутствием аппетита, слабостью, изнеможением и гибелью. При острой, подострой и хронической формах признаками болезни могут быть локализованное распухание, лихорадка; а при хронической форме единственным признаком может быть увеличенные лимфатические узлы.
Идентификация агента. Bacillus anthracis без труда поддается выделению в относительно больших количествах из крови и тканей животных, павших от сибирской язвы в недавнем прошлом; также B. anthracis имеет довольно характерную структуру колонии после инкубации в течение ночи на кровяном агаре. Колония довольно большая, примерно 0,3-0,5 см в диаметре. Она серо-белого до серого цвета, негемолитическая, по виду напоминающая шершавое матовое стекло, имеет очень клейкую, маслянистую консистенцию. Вегетативные клетки B. anthracis - большие, 3-5 мкм в длину и приблизительно 1 мкм в ширину. В конце экспоненциальной фазы роста клетки образуются эллипсоидальные центральные споры, которые не раздувают спорангий. Клетки интенсивно окрашиваются по Граму, часто in vitro наблюдаются длинные цепи, а in vivo - спаренные и короткие цепи. Визуализация инкапсулированных бацилл, обычно в больших количествах, в мазке крови, окрашенном полихромным метиленовым синим (реакция Мак-Фадьена) является однозначным диагностическим критерием.
|
|
|
Серологические тесты. Обнаружение антител в сыворотке инфицированных животных редко используется для диагностических целей, но является весьма важным инструментом научных исследований. Доминирующей процедурой на сегодняшний день является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).
|
|
|
Требования к вакцинам и диагностическим препаратам: Наиболее широко используемой вакциной против сибирской язвы для скота является вакцина, разработанная Max Sterne в 1937 г., которая представляет собой живые, неинкапсулированные, спорообразующие бактерии, содержащиеся в суспензии. В России и некоторых Восточно-Европейских странах используется эквивалентный тип вакцины
(штамм 55). Список производителей указан в руководстве по сибирской язве Всемирной организации здравоохранения.
А. ВВЕДЕНИЕ
Сибирская язва – острая бактериальная болезнь главным образом травоядных животных, передается людям. Этиологическим агентом является спорообразующие, грамположительные, палочковидные Bacillus anthracis. Сибирскаяязва также известна в мире и под другими названиями, такими как антракс, болезнь сортировщиков шерсти, болезнь старьёвщиков, злокачественный карбункул и злокачественная пустула.
Животные заражаются при проглатывании спор или, возможно, после укуса мух, которые питались инфицированным животным или его трупом. Инфицированных животных обычно находят павшими, так как смерть наступает в течение 24 часов. Тщательное патологоанатомическое обследование недавно павших животных может продемонстрировать любое количество поражений, из которых ни одно не будет патогномоничным или полностью сообразным данной болезни. Во избежание контаминации окружающей среды патологоанатомические обследования туш животных, в отношении которых существует подозрение, что они погибли от сибирской язвы, не поощряется. Наиболее часто наблюдаемые поражения это генерализованная септицемия, часто сопровождающаяся увеличением селезенки с консистенцией «черничного джема» и плохим сворачиванием крови. Можно наблюдать кровотечения из носа, рта, влагалища и/или ануса при смерти.
|
|
|
Грамположительная, палочковидная Bacillus anthracis являетсяоблигатным патогеном. Большинство других видов Bacillus являются повсеместно распространенными обитающими в окружающей среде сапрофитами, некоторые из них, а именно B. cereus, B. licheniformis и B. subtilis, иногда ассоциируются с пищевым отравлением у людей и с другими клиническими проявлениями, как у людей, так и у животных.
Риск зооноза и требования к биобезопасности
Более 95% случаев сибирской язвы у людей имеют кожную форму и являются результатом контактирования с инфицированными тушами или шкурами, мясом или костями таких туш. Bacillus anthracis не является инвазивной и требует поражения для инфицирования. Защитой для ветеринаров и других людей, работающих с животными, является ношение перчаток и другой защитной одежды при работе с образцами от туш с подозрением на заражение сибирской язвой, и запрет на протирание руками лица или глаз. Риск желудочно-кишечной формы сибирской язвы может возникать у людей, которые едят мясо животных, инфицированных сибирской язвой.
|
|
|
Риск вдыхания инфекционных доз становится значительным при работе, связанной с переработкой побочных продуктов животного происхождения при производстве товаров (промышленная сибирская язва). Это включает дубление, производство шерсти и волос животных, ковров, переработки костей и других отраслей промышленности, где существует возможность аэролизации значительного количества спор, что повышает риск подвергания инфекционным дозам. Важно, чтобы промышленные работники использовали соответствующую защитную одежду и оборудование, и выполняли стандартные операционные процедуры, которые минимизируют риск передачи. Высокопроизводительное вытяжное оборудование должно быть расположено над щипальными, гребнечесальными, ворсовальными и прядильными машинами. Приборы,
использующие воздушные потоки, нельзя использовать для очистки оборудования по причине риска распространения спор.
С клиническими образцами и культурами B. anthracis следует работать в условиях третьего уровня биобезопасности с соблюдением соответствующих процедур по биобезопасности и сдерживанию в соответствии с анализом биологических рисков , как описано в Главе 1.1.2 Биозащита и биобезопасность в ветеринарной микробиологической лаборатории и виварии. Рекомендуется вакцинация лабораторного персонала.
В. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Идентификация агента
Демонстрация инкапсулированных B. anthracis в мазках крови или тканей из свежих инфицированных сибирской язвой туш и выращивание организма на планшетах с кровяным агаром – относительно несложные процедуры, которые могут быть выполнены в большинстве бактериологических лабораторий. Трудности возникают со случаями болезни у свиней и плотоядных, у которых предсмертная бактериемия часто остается незамеченной, или у животных, которые перед смертью получали антибиотики.
Выделение B. anthracis из старых разложившихся туш, из образцов переработанных материалов (кости, мука, шкуры) или образцов из окружающей среды (контаминированная почва) часто также затруднено и требует осуществления обязательных и трудоемких процедур. Однако живые споры можно выделить из носовых раковин павшего скота и диких животных в течение длительного периода после смерти (M. Hugh-Jones, личная переписка).
1.1. Культивирование и идентификация Bacillus anthracis
Свежие образцы
Bacillus anthracis хорошо растет на многих типах питательного агара, однако лучше в качестве диагностической среды использовать агар с 5-7% лошадиной или овечьей кровью. Кровь – основной клинический материал для исследования. Мазки крови, другие жидкости организма и мазки, взятые из разрезов в тканях или органов можно нанести на планшеты из кровяного агара. После инкубации в течение ночи при 37 оС наблюдаются колонии B. anthracis серо-белого до белого цвета, 0,3 – 0,5 мм в диаметре, негемолитические с влажной поверхностью, напоминающей матовое стекло, и очень липкие, когда по ним проводят петлей для инокуляции. Иногда наблюдаются хвосты и выступающие пучки культуры, тянущиеся за родительской колонией, все в одном направлении. Данная характерная особенность описывалась как "голова медузы" или "кудрявые волосы". Подтверждение присутствия B. anthracis можно осуществить посредством демонстрации в культуре крови капсулированной, спорообразующей грамположительной палочки. Отсутствие подвижности – дополнительный тест, который можно провести.
Фаги, специфичные к сибирской язве, были впервые выделены в 1950-ых, а гамма фаг был впервые описан в 1955 г. (Brown и Cherry, 1955 г. ) и быстро стал стандартным диагностическим фагом для сибирской язвы. Гамма фаг принадлежит семейству близкородственных фагов сибирской язвы (Всемирная организация здравоохранения, ВОЗ, 2008 г.).
Два теста, подтверждающих идентичность B. anthracis, это лизис гамма фага и восприимчивость к пенициллину. Типичная процедура для этих тестов – это произвести посев подозрительных B. anthracis на кровяной планшет или планшет с питательным агаром и поместить 10-15 мкм каплю суспензии фага на одну сторону посева и 10-единичный пенициллиновый диск на другую сторону. Дать капле суспензии фага просочиться в агар до инкубации планшета при 37 ºС. Контрольную культуру, напр. вакцины Sterne или штамм NCTC 10340, следует тестировать одновременно с подозрительной культурой, чтобы продемонстрировать предполагаемую реакцию для лизиса гамма фага и восприимчивости к пенициллину. Если подозрительная культура является B. anthracis, в зоне под фагом не будет происходить рост бактерий по причине лизиса, и вокруг пенициллинового диска будет видна чистая зона, что указывает на восприимчивость к антибиотикам. Следует отметить, что некоторые полевые изоляты B. anthracis могут быть резистентными к фагам или пенициллину. Так как на проведение исследования по изучению лизиса гамма фага может повлиять плотность бактериального инокулума, Abshire et al. (2005) рекомендуют обесцвечивание подозрительной культуры на агаровом планшете в нескольких квадрантах вместо того, чтобы использовать формат засева и инокуляции капли гамма фага на первый и второй квадрант на планшете. Если подозревается присутствие B. anthracis, резистентных к антибиотикам или фагам, то можно применять диагностические методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Суспензии фага можно получить из центральных ветеринарных лабораторий или центральных медицинских лабораторий.
Фаг можно размножить и сконцентрировать в соответствии со следующим протоколом. Хранить фаг при 2-4 ºС и не замораживать фаг, так как он быстро становится нежизнеспособным.
Этап один
i i) Распределить по поверхности планшета с кровяным агаром вакцинный штамм B. anthracis Sterne. Инкубировать в течение ночи при 37 ºС.
ii ii) Инокулировать приблизительно 10 мл питательного бульона культурой с планшета с кровяным агаром и инкубировать при 37 ºС в течение приблизительно 4 часов до тех пор, пока он не станет мутным, затем охладить.
iii iii) Распределить 100 мкл культуры из этапа ii на трех предварительно просушенных планшетах с кровяным агаром, инкубировать при 37 ºС в течение 30 – 60 минут.
iv iv) Распределить 100 мкл суспензии фага, подлежащего амплификации на тех же планшетах. Инкубировать при 37 ºС в течение ночи.
v v) Собрать культуру, лизированную фагом на планшете с кровяным агаром, в 5 мл питательного бульона, затем провести второе промывание 5 мл питательного бульона. Инкубировать в течение ночи при 37 ºС.
vi vi) Профильтровать (0,45 мкм) и подсчитать, капая 20 мкл каплями (три капли на разведение) десятикратных разведений фильтрата в физиологическом растворе на посевы культуры B. anthracis, приготовленном как в этапе iii.
Этап два
Это практически одна и та же процедура, как и в Этапе один, обычно используется фильтрат из этапа vi, чтобы собрать фаг из планшетов.
i vii) Приготовить три засева штамма Sterne на планшете с кровяным агаром, как в этапе iii. Инкубировать при 37 ºС в течение 30 – 60 минут.
ii viii) Распределить 100 мкл фага из этапа vi. Инкубировать в течение ночи при 37 ºС.
iii ix) К 9 мл фильтрата из этапа vi, добавить 1 мл питательного бульона с 10 х концентрацией.
iv x) Собрать фаг из этапа viii с 5 мл раствора из этапа ix, затем провести второе промывание 5 мл остатком раствора из этапа ix.
v xi) Добавить 10 мл 1х питательного бульона.
vi xii) Инкубировать при 37 ºС в течение ночи, профильтровать и подсчитать.
Этап три
i xiii) Инокулировать 100 мл бульона с сердечно-мозговым экстрактом с приблизительно 2,5 мл культуры из этапа ii. Инкубировать на ротационном шейкере при 37 ºС, пока не станет мутным.
ii xiv) Добавить 20 мл фильтрата из этапа xii и продолжать инкубацию в течение ночи.
iii xv) Получившийся фильтрат проверяют на стерильность и проводят титрование в десятикратных разведениях на посевах вакцинного штамма, как в этапе vi для определения концентрации фага. Она должна составлять примерно 108- 109 бляшкообразующих единиц на мл.
Визуализация капсул
Вирулентная инкапсулированная B. anthracis присутствует в тканях, крови и других жидкостях организма животных, умерших от сибирской язвы. Можно подготовить тонкие мазки из крови, взятой из ушных вен или других периферийных вен, из экссудата, отобранного из различных отверстий, и в отношении лошадей и свиней, из отечной жидкости или поверхностных лимфатических узлов в районе шеи. Однако если животное мертво более 24 часов, капсулу может быть трудно выявить. Бактерии следует искать в мазках таких проб, которые были высушены, фиксированы либо с помощью тепла, либо погружая мазок в 95-100% спирт в течение минуты, и высушены на открытом воздухе, а затем окрашены полихромным метиленовым синим (реакция Мак-Фадьена). Капсулы окрашиваются в розовый цвет, тогда как клетки бацилл окрашиваются в синий. Клетки обнаруживают в парах или в виде коротких цепочек, они часто имеют прямоугольную форму на концах (цепи иногда напоминают ряд железнодорожных вагонов, так называемый внешний вид в виде вагонов или соединенных бамбуковых палочек). Окрашивание по Грамму или по Гимза капсул не обнаруживает. При выращивании B. anthracis аэробно на питательном агаре или в питательных бульонах капсулы отсутствуют, но их можно видеть, когда вирулентную бактерию культивируют в течение нескольких часов в нескольких миллилитрах крови (лучше всего показала себя дефибринированная кровь лошадей или овец). Альтернативно, образование капсул наблюдается при культивировании вирулентной B. anthracis на питательном агаре, содержащем 0,7% бикарбонат натрия, и инкубации в присутствии СО2 (оптимально 20%, но и при использовании сосуда со свечой тоже получают хорошие результаты). Приготовление агара осуществляют посредством восстановления достаточного количества порошка, являющегося основой питательного агара, для получения 100 мл агара в 90 мл воды. Затем он автоклавируется и охлаждается до 50ос на водяной бане; затем добавляют 10 мл стерилизованного посредством фильтрации (фильтр: 0,22-0,45 мкм) 7% раствора бикарбоната натрия. Перемешивают и наливают в чашки Петри. Инкапсулированные B. anthracis будут образовывать мукоидные колонии, визуализацию
капсул можно произвести путем нанесения тонких мазков на предметные стекла, с последующей фиксацией и окрашиванием полихромным метиленовым синим (реакция Мак-Фадьена).
Полихромный метиленовый синий можно приготовить следующим образом: 0,3 г метиленового синего растворяют в 30 мл 95% этанола; 100 мл 0,01 % гидроксида калия (КОН) смешивают с раствором метиленового синего. В идеале рекомендуется оставить на открытом воздухе, периодически встряхивая, в течение, по крайней мере, одного года для оксидации и выдержки. Добавление К2СО3 (к конечной концентрации 1%) ускоряет «созревание» красителя, но до того, как он считается диагностически надежным, его эффективность следует протестировать вместе с ранее использовавшейся функциональной партией красителя на надежных образцах. Было обнаружено, что красители, которые дают положительную реакцию на культуре B. anthracis, полученной искусственным путем в крови лошадей, иногда не дают положительные результаты в полевых условиях.
При подготовке мазков для окрашивания необходимо использовать только небольшие капли крови или жидкостей тканей, наилучшими являются тонкие, маленькие мазки. После закрепления (нагревая или погружая мазок в 95-100% спирт в течение 1 минуты) и высушивания маленькую (примерно 20 мкг) каплю красителя помещают на мазок и распределяют с помощью инокулирующей петли. Через одну минуту пятно промывают водой, промакивают, высушивают воздухом и рассматривают под объективом с ×10 линзами, где можно увидеть короткие цепочки в виде коротких волосков; после обнаружения их можно наблюдать при погружении в масло (×1000) в виде розовых капсул, которые окружают бациллы, окрашенные в синий и черный цвет. Чтобы избежать лабораторной контаминации, слайд и фильтровальную бумагу автоклавируют или оставляют на несколько часов в 10% растворе гипохлорит натрия.
Другие образцы
Идентификация B. anthracis в старых разложившихся образцах, материалах, подвергнутых обработке, и образцах из окружающей среды, включая почву, возможна, но в этих пробах часто присутствуют сапрофитные контаминанты, которые на неизбирательных агарах растут быстрее, чем B. anthracis, и маскируют последние. Предлагаются следующие процедуры:
а) Образец размешивают в двух объемах стерильной деионизированной или дистиллированной воды и помещают на водяную баню при 62, 5±0,5оС на 30-60 минут.
b) Затем осуществляют приготовление десятикратных разведений до 10-2 или 10-3. Из каждого разведения 10-100 мкл наносят на кровяной агар и в некоторых случаях 250-300 мкл на PLET агар (полимиксин, лизозим, EDTA [этилен диамин тетрауксусная кислота] ацетат таллоса) (7, 11). Все планшеты инкубируют при 37 оС.
с) После инкубации в течение ночи чашки с кровяным агаром обследуют на наличие типичных колоний, как описано выше, а чашки с PLET агаром обследуют через 40-48 часов. Подтверждение идентичности, т.е. подтверждение, что подозреваемые колонии являются колониями B. anthracis, производится, как описано ранее.
Приготовление PLET среды (Kinsley, 1966; ВОЗ, 2008) производят, используя основу в виде мясо-пептонного бульона (экстракт сердца) (DIFCO), приготовленного согласно инструкциям производителя с добавлением 0,25-0,3 г/литр этилен диамин тетрауксусной кислоты и 0,04 г/литр ацетата таллия. Смесь автоклавируют и равномерно остужают до 50оС, затем добавляют полимиксин, 30 000 единиц/литр, и лизозим 300 000 единиц/литр. После тщательного перемешивания агар распределяют по чашкам Петри.
Существует информация о процедурах прямого обнаружения B. anthracis в почвах и других образцах из окружающей среды, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Ни одна из данных процедур в настоящее время не используется в повседневной практике.
Если все другие методы были безрезультативными, можно рассмотреть вопрос о заражении животных для выделения B. anthracis. Это может производиться, например, когда образцы представлены от животных, которым перед смертью проводили терапию антибиотиками, или в случае, когда представлены образцы из окружающей среды, содержащие споростатические химические вещества. Учитывая набирающее силу движение по исключению использования животных для биологического тестирования, данный подход следует использовать в крайнем случае и только, если его использование обосновано. Из животных предпочтительнее использовать взрослых мышей или морских свинок. Если образцы включают почву, животных следует подвергнуть предварительной обработке: за день до тестирования ввести антисыворотку либо к столбняку, либо к газовой гангрене. Подготовка образцов производится как при культивировании, включая температурный шок при 62,5оС в течение 15 минут. Мышей инъецируют подкожно 0,05-0,1 мл; морских свинок заражают внутримышечно до 0,4 мл (0,2 мл в мышцу каждого бедра). Любое присутствие B. anthracis приводит к гибели в течение 48-72 часов, а организм можно культивировать из крови, как описано выше.
Дата добавления: 2022-06-11; просмотров: 15; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!