Подсчёт количества сперматозоидов и других форменных элементов спермы в 1 мл эякулята
Для подсчёта общего количества сперматозоидов используют разво- дящую жидкость для их обездвиживания. В этих целях можно приме- нять:
—раствор Барбагалло (7 мл 40% формалина и 93 мл 0,85% раствора NaCl);
—3% раствор уксусной кислоты ;
—10% раствор карболового фуксина;
—1% раствор синьки
Так как эякулят имеет повышенную вязкость, для взятия точного объёма следует использовать стеклянные пипетки, поскольку автомати- ческие семплеры с коническим наконечником могут привнести значи- тельную погрешность при работе с вязкими растворами. Рекомендуются следующие варианты разведения спермы в пробирке:
—20 мкл спермы + 0,4 мл фиксирующей жидкости (разведение 1/20)
—20 мкл спермы + 0,8 мл фиксирующей жидкости (разведение 1/10)
—20 мкл спермы + 1,6 мл фиксирующей жидкости (разведение 1/5)
Если сперма богата сперматозоидами, её разводят в 10 раз. Проводится подсчёт сперматозоидов в 5 больших квадратах камеры Горяева, распо- ложенных по диагонали (для получения более точного результата при неравномерном распределении клеточных элементов). Лучше использо- вать большие квадраты, разделённые пересекающимися линиями на 16 маленьких. Это важно при очень большом количестве клеток, которые проще считать послойно по маленьким квадратам, чем в одном большом. Если сперматозоид расположен на границе квадрата, то он учитывается по расположению его головки (внутри квадрата – считается, вне квадра- та – не считается). Расчёт ведут по формуле:
|
|
|
 |
где А – количество сперматозоидов в 5 квадратах;
250 – 1/250 – объём одного большого квадрата камеры Горяева; 10 – степень разведения спермы,
1000 – содержание спермы в 1 мл эякулята;
5 – количество квадратов, в которых подсчитаны сперматозоиды. Если количество сперматозоидов в эякуляте очень большое (поли-
зооспермия), сперму разводят в 20, 50 или 100 раз.
В расчётах учитывают степень разведения:
Х = А×1 000 000 при разведении в 20 раз; Х = А×2 500 000 при разведении в 50 раз; Х = А×5 000 000 при разведении в 100 раз.
Если в эякуляте количество сперматозоидов значительно снижено, в 1 мл для их обездвиживания добавляют 2 капли раствора Барбагалло, тщательно перемешивают, заполняют камеру и считают сперматозоиды в 5 больших квадратах. Расчёт ведут по формуле:
 |
Если сперматозоиды единичные в поле зрения при исследовании на- тивного препарата, их также обездвиживают, добавляя в 1 мл эякулята 2 капли раствора Барбагалло, заполняют камеру Горяева и подсчитывают в 100 больших квадратах (как лейкоциты). Расчёт ведут по формуле:
 |
Если сперматозоидов очень мало (менее 1-2 в поле зрения при ×400), рекомендуется центрифугировать эякулят в течение 15 минут. Со ско ростью 1500 об/мин следует удалить надосадочную семенную плазму, измерить её объём, подсчитать количество сперматозоидов в счётной ка- мере Горяева и оценить их подвижность. В бланке-ответе отметить, что сперма была подвергнута центрифугированию, т.к. этот процесс влияет на подвижность и морфологию сперматозоидов.
|
|
|
Общее количество сперматозоидов в эякуляте
Количество сперматозоидов в эякуляте рассчитывают, умножая ко- личество в 1 мл спермы на весь объём материала. Например, объём до- ставленной спермы – 5 мл, количество сперматозоидов в 1 мл эякулята
– 30 000 000 : 30 000 000 × 5 = 150 000 000 в доставленной сперме.
Морфология сперматозоидов
Традиционное исследование морфологии сперматозоидов прово- дится путём микроскопирования нативного прижизненного препарата (увеличение ×400). Использование такого метода не позволяет оценить многие морфологические изменения в структуре сперматозоида. В по- следние годы были предложены новые более детальные методы анализа, основанные на приготовлении препаратов эякулята с последующим их окрашиванием красителями, позволяющими чётко различать структуру клеток. Это дало возможность не только детально характеризовать мор- фологическую структуру сперматозоида, но также дифференцировать лейкоциты и клетки герминативного эпителия от других «круглых кле- ток». Такие методы позволяют выявить аномалии, неразличимые при стандартном анализе.
|
|
|
В лабораториях нашей страны для окраски препаратов, приготов- ленных из спермы, применяют унифицированные гематологические ме- тоды – окрашивание по Нохту, Романовскому–Гимзе или Паппенгейму– Крюкову. В большинстве андрологических лабораторий используется метод окраски по Папаниколау.
Для исследования морфологической структуры сперматозоидов из свежей спермы готовятся два препарата. При концентрации сперматозои- дов около 20×106 клеток/мл или выше для мазка можно взять 5 мкл спер- мы. Если концентрация менее 20×106 клеток/мл, на предметное стекло помещается 10-20 мкл спермы, которая равномерно распределяется по стеклу. При очень низкой концентрации (менее 10×106 клеток/мл) препара- ты готовятся из осадка, полученного после центрифугирования спермы. Хорошие препараты для окрашивания получить трудно, поскольку раз- ная вязкость приводит к неравномерному распределению сперматозои- дов. Поэтому при наличии большой вязкости семя может быть промыто физиологическим раствором, отцентрифугировано, супернатант отбро шен. Осадок необходимо ресуспензировать до концентрации, удобной для получения препарата.
|
|
|
Окрашенные препараты анализируются с иммерсионным маслом под объективом ×100. Переходя от поля к полю, анализируется каждый из 100, а лучше из 200 сперматозоидов для уменьшения их вариабель- ности. Оценивается процентное соотношение в эякуляте морфологиче- ски нормальных и измененных сперматозоидов (в целом и по отдельным видам изменений). У каждого сперматозоида характеризуются строение головки, состояние акросомы, наличие цитоплазматической капли, де- фектов средней части и хвоста (см. рисунок).
Строение сперматозоида
По критерию ВОЗ головка нормального сперматозоида должна быть овальной формы и иметь длину 4,0-5,5 мкм, ширину 2,5-3,5 мкм, отно- шение длины к ширине 1,5-1,75. Средняя часть должна быть тонкой, око- ло 1 мкм шириной и в 1,5 раза длиннее головки, хвост – прямым, тоньше средней части и около 45 мкм длиной. Свёрнутый хвост может свиде- тельствовать о низкой подвижности сперматозоидов, а при их большом скоплении – о гипоосмотическом стрессе. Цитоплазматическая капля у нормального сперматозоида не должна превышать 0,3 длины головки.
Кроме оценки морфологии, согласно строгим критериям, необходи- мо обращать внимание на состояние акросомальной области. Нормальная акросома должна быть хорошо определяемой и занимать от 40 до 70%
головки. Головка сперматозоида может классифицироваться как нор- мальная только в том случае, если она имеет нормальную акросому. Все остальные формы сперматозоидов считаются морфологически аномаль- ными.
Дата добавления: 2021-02-10; просмотров: 70; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!