Перекрестный иммуноэлектрофорез (перекрестный электрофорез в системе антиген-антитело)
Настоящий метод можно рассматривать как электроиммуноанализ белков, предварительно разделенных методом электрофореза (рис. 10). Исторически этот метод появился раньше, чем электроиммуноанализ, поскольку Лорелл описал его в 1965 г., тогда как электроиммуноанализ был применен им в 1966 г. в качестве метода, позволяющего использовать возможности перекрестного иммуноэлектрофореза для количественных определений. Существуют два основных варианта перекрестного иммуноэлектрофореза. Первый вариант — это исходный метод, предложенный Лореллом. Подробное его описание (включая ряд модификаций) было сделано Ганротом. Второй вариант представляет собой модификацию первоначального метода. Согласно варианту Лорелла, в канавку вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в агарозном геле так, как это описано Иохансоном. Электрофореграмму разрезают по длине и каждую полоску помещают в канавку соответствующего размера, вырезанную в геле, содержащем антитела. В модифицированном методе электрофореграмму, полученную при электрофорезе в первом направлении, целиком переносят на вторую пластинку, а свободную поверхность пластинки заливают гелем, содержащим антитела. Метод Лорелла обладает более высокой разрешающей способностью. С другой стороны, он пригоден лишь для сравнительного исследования компонентов на одной электрофореграмме, тогда как модифицированный метод позволяет осуществлять анализ известных количеств белков и, таким образом, обеспечивает возможность количественного сравнения компонентов на разных пластинках.
|
|
|
Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос. Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Иохансон и Иертен, а также Вейс и др. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при рН 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом рН была близка к нулю.
|
|
|
Замечания по технике проведения перекрестного иммуноэлектрофореза. В оригинальной методике Лорелла при электрофорезе в первом направлении рекомендуется вырезать канавку для образца размером 1ХЮ мм. Кроме того, необходимо использовать буфер, обладающий не слишком низкой ионной силой (например 70 мМ вероналовый буфер, рН8,6), и высокое напряжение (до 20 В/см) с эффективным охлаждением системы. Для электрофореза во втором направлении из центральной части электрофореграммы вырезают полоску шириной 2—5 мм и переносят ее на пластинку геля, которую готовят по способу, рекомендуемому для электроиммуноанализа. Разрезать гель следует по линейке острой и тонкой бритвой, чтобы уменьшить выделение жидкости с поверхности среза. В геле, содержащем антитела, делают два параллельных разреза недалеко от его катодного конца. Перенос полоски геля является очень ответственным этапом. Предварительно со стеклянной пластинки удаляют весь окружающий гель, а капли жидкости высушивают фильтровальной бумагой. Полоску геля переносят с помощью тонкого стального лезвия на край тонкого предметного стекла. Затем прилипшую к нему полоску геля переносят в канавку, вырезанную в геле для второго направления (рис. 9,А).
|
|
|
Оба этапа электрофореза проводят на пластинках геля размером 10X20 см. Второй гель может вмещать две или больше полосок, перенесенных с первого геля (в зависимости от длины электрофореграммы, полученной в первом направлении). Соответствующую концентрацию антисыворотки подбирают эмпирическим путем; обычно она бывает в 1,5—2 раза выше оптимальной концентрации, используемой для электроиммуноанализа. Антиген, концентрация которого может варьировать в пределах 50—500 мкг/мл, вносят в гель первого направления в объеме 10 мкл -(на второй гель переносят около одной трети указанного количества). Соотношение количеств антигена и антител должно быть подобрано таким образом, чтобы пики преципитации были высотой 10—30 мм. Более высокие пики могут ухудшить разрешение, а слишком малые трудно использовать для количественного определения.
В модифицированном методе оба этапа электрофореза проводят на стеклянных пластинках размером 8Х11 см. Для антигенов вырезают четыре круглые лунки. На первом этапе электрофореза, осуществляемом при напряжении 10—15 В/см, применяют охлаждение. После завершения электрофореза по краям пластинки удаляют слой геля шириной 10 мм, а остальной гель разрезают на четыре полоски, параллельно направлению электрофореза. Тонким лезвием бритвы каждую полоску переносят на стеклянную пластинку такого же размера, как и первая (рис. 9). Полоску геля помещают на край пластинки, а ее свободную поверхность заливают агарозой, содержащей антитела. После того, как второй гель застынет, проводят электрофорез во втором направлении при низком напряжении (2— 2,5 В/см) в течение 18—22 ч.
|
|
|
Описанный метод используют главным образом для одновременного количественного определения всех компонентов какой-либо гетерогенной смеси. Для этой цели нужна антисыворотка, содержащая антитела ко всем анализируемым компонентам, причем титр этих антител должен быть достаточно высоким, чтобы образовались преципитаты, поддающиеся измерению. Подобную «сбалансированную» антисыворотку трудно получить путем иммунизации. Ганрот предлагает готовить антисыворотки высокого титра для нескольких антигенов, а затем смешивать их в таком соотношении, при котором обеспечивается адекватное содержание антител для каждого антигена. Очевидно, более выгодно использовать при перекрестном иммуноэлектрофорезе смесь антигенов в двух разных концентрациях. Само количественное определение заключается в измерении площадей под пиками преципитации. Его можно провести с помощью полуавтоматического электронного планиметра. Другой способ состоит в том, что пластинку проецируют на лист белой бумаги, пики обводят карандашом, вырезают и взвешивают. Если методика электрофореза отличается высокой воспроизводимостью и форма преципитатов близка к симметричной, то площадь пика можно рассчитать, умножая его высоту на ширину, измеренную на половине высоты пика. Количественное определение можно сделать более точным, если использовать «внутренний» стандарт, который в известном количестве добавляется к образцу. Такое вещество при электрофорезе в первом направлении должно мигрировать в зону, не содержащую анализируемых белков. При исследовании белков сыворотки крови в качестве «внутреннего»' стандарта служил ацетилированный альбумин. Вееке рекомендует применять для этой цели карбамилированный трансферрин. Площадь всех остальных пиков сравнивают с площадью пика, образуемого внутренним стандартом, и результаты выражают в относительных единицах. Идентификация отдельных антигенов в сложной смеси представляет собой довольно трудную задачу. Если имеется очищенный антиген, то его можно добавлять к анализируемой смеси, и при этом будет наблюдаться увеличение соответствующего пика преципитации. Можно, наоборот, добавлять к смеси антигенов моноспецифическую антисыворотку,, что приведет к уменьшению пика соответствующего антигена. Другая возможность заключается в том;, что между гелем первого направления и гелем:, содержащим полиспецифические антитела, помещают гель, содержащий один из антигенов в очищенной форме. Движущийся из промежуточной зоны антиген образует продольную линию преципитации, которая сольется с пиком преципитации идентичного антигенного компонента смеси, разделенной в первом направлении (рис 11).
Кроме иммунохимических методов для идентификации некоторых компонентов можно ' применять специфические методы окрашивания или связывания со специфическими лигандами (например, таким образом обнаруживают в сыворотке гапто-глобины или тироксинсвязывающие белки).
Дата добавления: 2021-01-21; просмотров: 67; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!