Среда Бабича М.А., Дигальцева Ю.М. и Фоменко А.С.

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 2

A. Основа среды (95-97% общего объема среды) — ¹/₅₀ М фосфатный
буфер, который автоклавирован при 127°С в течение 1,5 часов.

Б. Альбуминовая фракция сыворотки крови овец. Готовится методом высаливания; диализированный раствор альбумина фильтруют через пластины «СФ» и добавляют к основе среды 150-250 мг% (в пересчете на сухое вещество).

B. Фактор роста — состоит из нативного экстракта печени овец с включением витаминов, микроэлементов и биоактиваторов. В процессе изготовления нативного экстракта печени к нему добавляют: хлористого магния — 25 мг/л; молибденового натрия — 1 мг/л, хлористого цинка — 2 мг/л, карбамида —10 мг/л, никотиновой кислоты — 2 мг/л, калиевой соли индолиуксусной кислоты — 2 мг/л, тиамина — 20 мг/л, рибофлавина — 0,1 мг/л, кобаламина —
0,02 мг/л. Этот фактор добавляют к основе среды в количестве 0,5-1%.

Твин-альбумин сывороточная среда Эллиса. В 998 мл дистиллированной воды растворяют Na₂HP0₄ — 1 г, КН РО₄— 0,3 г, NH₄C1 — 1 мл, глицерин — 1 мл; растворяют компоненты, устанавливают рН 7,4, удаляют 140 мл среды, вносят 1,5 г очищенного агара, стерилизуют (121° С, 20 мин), охлаждают до 50° С, добавляют 140 мл основной среды, фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,22 микрон и разливают по пробиркам.

Приготовление растворов компонентов среды: в 100 мл стерильной дистиллированной воды растворяют раздельно ZnSО₄ х 7Н₂О — 0,4 г, СаС1₂ хх 2Н₂О —1,0 г, глицерина — 10,0 мл, NH₄C1 — 25 г, витамин В,₂ — 0,02 г, тиамин — 0,5 г, MgSО₄ — 0,3 г. Растворы до использования можно хранить до 30 суток при 4 —5° С. Ex tempore готовят следующие растворы компонентов. В дистиллированной воде разводят FeSО₄x7Н₂О — 0,5 г/ 100 мл Н₂О, твин-80 — 20 мл/180 мл Н₂О, твин-40 — 20 мл/180 мл Н₂О, 5-флюорацил —1,0 г/100 мл Н₂О, налидиксовая кислота —1,0 г/100 мл Н₂О, MgCl,x 6H₂О — 0,016 г/100 мл Н₂О.

Приготовление основной среды: в 50 мл стерильной дистиллированной воды растворяют 10,0 г бычьего альбумина, 1,0 глактальбумина-гидролизата, затем вносят растворы тиамина — 1 мл, СаС1₂ х 2Н₂О — 1 мл, MgSО₄ — 1 мл, ZnSО₄x 7 Н₂0 — 1 мл, MgCl₂x6Н₂О — 1 мл, ZnSО₄ x 7 Н₂О — 1 мл, FeS0₄ x 7 Н₂0 — 10 мл, витамина В₁₂ — 1 мл, твина-80 — 9 мл, твина-40 — 3-5 мл. После растворения компонентов устанавливают рН 7,4, вносят дистиллированную воду до 96 мл и 4 мл кроличьей сыворотки, инактивированной при 56° С (30 минут), флюорацила — 20 мл, налидиксовой кислоты — 20 мл.

Среда с 5-флюорацилом. В питательную среду (жидкую, полужидкую, плотную) вносят 100 - 400 мкг/мл 5-флюорацила.

Кампилобактериоз (вибриоз) – инфекционное хроническое заболевание крупного рогатого скота, овец, свиней, которое проявляется абортами, задержанием последа, бесплодием, вагинитами, метритами, рождением нежизнеспособного потомства. У кур возбудитель вызывает падеж цыплят, снижение яйценоскости несушек и прироста массы у бройлеров, у людей — гастроэнтериты, бактериемию, кожные поражения.

Возбудитель кампилобактериоза - бактерии семейства Spirillaceae, род Campylobacter . Основные виды: С. fetus (подвиды С. fetus venerealis и С. fetus fetus ), C . jejuni , С, sputorum (подвиды С. sputorum sputorum , С. sputorutn bubulus , С. sputorum faecalis ) и непатогенный С. coli . С. fetus вызывает аборты у овец, крупного рогатого скота.

С. fetus veneralis - патогенен для крупного рогатого скота.

C . jejuni вызывает аборты у овец, энтериты у телят, ягнят и других животных.

С. mucosalis патогенен для свиней, его выделяют от животных с признаками некротического энтерита.

Лабораторная диагностика кампилобактериоза основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим свойствам.

Материал для исследования. В лабораторию направляют абортированный плод (целиком с плодными оболочками или от крупных плодов голову, желудок, легкие, печень); плаценту; слизь из шейки матки, взятую стерильно в первые 3...4 дня после аборта или в период охоты; от быков-производителей - препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез; от убитых с диагностической целью животных - матку, влагалище, лимфоузлы тазовой области.

Микроскопия препаратов из исходного материала. Представители рода Campylobacter - грамотрицательные,полиморфные, тонкие палочки, изогнутые в виде «крыла чайки», запятой, спирали с одним или несколькими завитками или S-образные. Средние размеры (0,5...8) х (0,2...0,8) мкм. Подвижны за счет одного полярного жгутика на одном или обоих концах клетки, движение винтообразное; спор и капсул не образуют .

В мазках из патологического материала кампилобактерии обнаруживают в виде «крыла чайки», запятой или S-образной формы; от животных, подвергавшихся лечению, - в виде длинных спирилл, малоизвитых нитей и мелких кокковидных форм.

Выделение и идентификация возбудителя.Возбудитель - микроаэрофил, температурный оптимум 37...38°С. Для получения культуры кампилобактерии используют полужидкие и плотные питательные среды: плотный 2...3%-й МППА и полужидкий 0,2%-й мясо-печеночный пептонный агар (ПЖА), среду Кита-Тароцци без масла, агар Мартена, сафранино-железо-новобиоциновую (СЖН) среду. Для обогащения в питательные среды добавляют 5... 10 % дефибринированной крови крупного рогатого скота, овец, кроликов или сыворотку крови лошади. Культивируют в течение 6...10сут в микроаэрофильных условиях при замене 10...15% воздуха оксидом углерода. Контаминированный материал высевают на среду СЖН: полужидкий агар - 985 мл, 2%-й раствор сульфата железа — 5 мл, 0,5%-й водный раствор сафранина Т — 5 мл и 0,2%-й водный раствор новобиоцина — 5 мл. Среду фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки и автоклавируют при 115°С 25 мин. Готовая к использованию среда должна быть розового цвета, рН 6,8. При культивировании на данной среде кампилобактерий ее цвет не изменяется, другой микрофлоры — приобретает ярко-желтую окраску.

При культивировании на плотной среде кампилобактерии образуют через 3...4сут колонии: гладкие, бесцветные, диаметром 1 мм или шероховатые, непрозрачные, белые или кремовые до 2 мм в диаметре, могут быть плоские, серые или светло-коричневые с неровными краями, иногда в виде тонкого налета. На кровяном агаре гемолиза не дают.

При росте на сывороточном бульоне дают слабое помутнение, иногда с образованием незначительного рыхлого осадка, на полужидком агаре растут в виде серовато-голубого диска около поверхности среды.

У выделенных культур кампилобактерий изучают ферментативную активность, ростовые потребности и на основании полученных данных идентифицируют их на уровне вида, подвида, биовара (см. табл.).

Для серологической идентификации кампилобактерий выпускают агглютинирующие и люминесцирующие сыворотки против С. fetus (Первый тип), С. fetus venerealis (Второй тип), С. Sputorum bubulus (Третий тип).

Для ориентировочной идентификации выделенных культур ставят РА на стекле, используя сыворотки в разведении 1:50.

Для окончательной серологической идентификации кампилобактерий ставят пробирочную РА: готовят последовательные разведения каждой из трех моноспецифических сывороток в 3%-м растворе хлорида натрия, содержащем 0,3 % формалина, — 1 : 25, 1: 50, 1:100, 1: 200. Затем в каждую пробирку с указанными разведениями моноспецифических сывороток добавляют по 0,5 мл исследуемой суспензии вибрионов.

После внесения компонентов пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37 °С до следующего дня. Затем их выдерживают 3...4ч при комнатной температуре и учитывают результаты реакции.

При положительной реакции с моноспецифической сывороткой одного типа и отрицательной — с моноспецифическими сыворотками остальных двух типов исследуемый штамм относят к тому типу, с которым получен положительный результат.

При получении положительной реакции с двумя моноспецифическими сыворотками опыт повторяют с обеими моноспецифическими сыворотками, агглютинировавшими исследуемую суспензию вибрионов, применяя более высокие разведения, чтобы определить титр каждой сыворотки. Типовую принадлежность исследуемого штамма устанавливают по той моноспецифической сыворотке, которая агглютинирует микробную суспензию в более высоком титре.

Для идентификации возбудителей кампилобактериоза в реакции иммунофлуоресценции используют культуры, выращенные на общепринятых питательных средах.

Биопроба.Нативным материалом или выделенной культурой заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течение 10...12сут аборта не наступает, морских свинок убивают и исследуют содержимое полости матки и плоды. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и овцах, заражая их подкожно или перорально. Животные абортируют, при отсутствии аборта их убивают с диагностической целью.

Серологическая диагностика кампилобактериоза у коров основана на результатах реакции агглютинации с вагинальной слизью (РАВС), а у овец — РА с сывороткой крови.

Слизь берут марлевым тампоном, который помещают в пробирку с 5 мл формалинизированного 3%-го раствора хлорида натрия. Выдерживают при температуре 1...4°С 12...14 ч. Тампон отжимают, жидкость центрифугируют при 2500...3000 мин 30 мин.

После центрифугирования реакцию ставят с экстрактом вагинальной слизи в четырех разведениях (табл.). Для приготовления кампилобактериозного антигена исходную концентрированную суспензию бактерий разводят физиологическим раствором, содержащим 0,3 % формалина, в соотношении 1: 10.

Учет результатов: 1) положительная - реакция хорошо выражена (на три-четыре креста) во всех пробирках или только в 1-й и 2-й; 2) сомнительная - агглютинация на один-два креста в 1-й и во 2-й пробирках; 3) отрицательная - отсутствие агглютинации во всех пробирках.

У больных овец для исследования берут сыворотку крови, разводят ее в 100, 200 и 400 раз. Результат считают положительным, если исследуемая сыворотка дает положительную реакцию агглютинации в разведении 1:200 и выше на четыре или три крестасомнительным — на четыре или три креста в разведении 1:100 либо на два или один крест в разведении 1:200, отрицательным — если агглютинация отсутствует или ее оценивают не выше чем на два или один крест в разведении 1:100. Сыворотку овец, вакцинированных против кампилобактериоза, серологически не исследуют.

Кроме реакции агглютинации сыворотку животных можно исследовать в РСК, реакции иммунофлуоресценции или реакции иммунной сорбции антител, меченных ферментами. Разработаны диагностикумы для выявления антител в РНГА, пригодные для диагностики кампилобактериозов животных и человека.

Дизентерия свиней - инфекционная болезнь, характеризуется геморрагическим поносом и некротическим поражением толстого отдела кишечника. Восприимчивы свиньи всех возрастов, чаще болеет молодняк в возрасте 1-6 мес.

Возбудитель дизентерии свиней - спирохета Serpulina hyodysenteriae , род Serpulina .

Лабораторная диагностика дизентерии свиней основана на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии (основной метод), а также выделение чистой культуры посевом на питательные среды и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим и ферментативным свойствам.

Материал для исследования.Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, для посмертной — слизистую оболочку большой ободочной кишки, которую соскабливают после удаления из кишечника содержимого и промывания водой. От трупов материал берут не позднее чем через 2 ч после гибели животного, материал должен быть исследован в течение 2-4 ч, а при хранении на холоде — 6-8 ч.

Микроскопия препаратов из исходного материала.Поскольку культивирование возбудителя весьма трудоемко, микроскопическое исследование — это основной метод диагностики, доступный практическим лабораториям. Поступивший материал исследуют методом темнопольной, фазово-контрастной или обычной световой микроскопии.

При темнопольной микроскопии препарат «раздавленная капля» исследуют в водной иммерсии с объективом х 40 и окулярами х 7 или х 10. Возбудитель в этом случае виден как спиралевидная клетка с 3-12 правильными витками размером (7-9) х (0,3-0,4) мкм, движущаяся змеевидно-поступательно. При температуре 22°С наблюдают изгибание и скользящее движение клетки, а при 37-42°С клетка движется поступательно. У большинства больных дизентерией свиней в препарате «раздавленная капля» в одном поле зрения обнаруживают 5-10 спирохет и более. В окрашенных по Граму препаратах видны грамотрицательные извитые клетки со строением, типичным для спирохет. Клетки возбудителя хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе, фуксином Пфейффера.

Сходные по морфологии с Serpulina hyodysenteriaeвибрионы, обитающие в кишечнике, отличаются тем, что их клетка в 2...4 раза толще, с тупыми концами, движение вращательное вокруг длинной оси.

Выделение и идентификация культуры возбудителя.Возбудитель - строгий анаэроб, температурный оптимум 36-38°С, при 25 и 30 °С не растет, рН 7,0-7,2.

Для первичной изоляции используют селективные, среды, например следующие.

Кровяной агар со спектомицином: к перевару Хоттингера добавляют 0,001 % резазурина (индикатор), 0,5 % хлорида натрия, 0,25 % глюкозы, 1 % пептона, 2 % агара, кипятят, пропускают через среду азот или оксид углерода в течение 10-15 мин, устанавливают рН 7,0-7,2, вносят 0,05 % гидрохлорида цистеина. Среду автоклавируют при 110°С 30 мин, охлаждают до 40-45°С, пропуская при этом через среду стерильный обескислороженный газ, после чего вносят 10 % дефибринированной крови барана (или крупного рогатого скота) и 400мкг/мл спектомицина. Среду разливают в атмосфере оксида углерода.

Культивируют также в жидкой или полужидкой среде, содержащей сердечно-мозговую вытяжку и 10 % эмбриональной телячьей или кроличьей сыворотки. На кровяном агаре через 48-96 ч инкубирования при 38°С вырастают плоские просвечивающие колонии диаметром 0,5-3 мм с зоной β-гемолиза. В полужидком сывороточном агаре возбудитель растет в виде беловатого диффузного облачка ближе к поверхности среды.

После изучения морфологии и культуральных свойств у выделенных бактерий исследуют ферментативную активность. Патогенные для свиней культуры гидролизуют эскулин, не ферментируют фруктозу, утилизируют пируват, при сбраживании глюкозы образуют водород, углекислоту, ацетат, бутират; нитраты не восстанавливают; растут на средах, содержащих 6,5 % хлорида натрия, но не растут на средах с 1 % глицина.

Используемая литература

1. Ветеринарная микробиология иммунология: Учебник /Под ред. проф. Н. А. Радчука. - М.: Агропромиздат, 1991.

2. Ветеринарная микробиология и иммунология. Колычев Н. И. Омск 1996.

3. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. Справочник. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. М. Колос, 1995.

4. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. Костенко Т. С, Родионова В.Б, Скородумов Д.И. М.: Колос, 2001.

5. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. Справочник. Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С. М.: ИзографЪ, 2005.

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 107; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 12

Мы поможем в написании ваших работ!