Дифференциация патогенных и сапрофитных лептоспир по

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра микробиологии

Государственное управление ветеринарии

Краснодарского края

Государственное учреждение Краснодарского края

«Кропоткинская зональная ветеринарная лаборатория»

А.А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ,

Л.В. ШЕВЧЕНКО, В.Н. ШЕВКОПЛЯС

РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

ЛЕПТОСПИРОЗА, КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА И

ДИЗЕНТЕРИИ ЖИВОТНЫХ

                                    

        

КРАСНОДАР, 2008

Авторы:

Шевченко А.А., Черных О.Ю., Шевченко Л.В.,  Шевкопляс В.Н.

Рекомендации по лабораторной диагностике лептоспироза, кампилобактериоза и дизентерии животных.

Краснодар: КубГАУ, 2008. 29с.

В рекомендациях освещены свойства возбудителей лептоспироза, кампилобактериоза и дизентерии, методы их лабораторной диагностики и питательные среды для выращивания.

Для студентов высших учебных заведений по специальности «ветеринария», аспирантов, научных сотрудников.

 

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

И.А. Болоцкий – доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией Краснодарского НИВИ

Ю.Ф. Мишанин - доктор биологических наук, академик РАЕ,

профессор Кубанского государственного технологического университета.

 

 

   Лептоспироз — инфекционная, природно-очаговая болезнь многих видов животных и птиц, проявляющаяся лихорадкой, гемоглобинурией, желтуш­ным окрашиванием и некрозами слизистых оболочек и кожи, атонией желу­дочно-кишечного тракта, абортами, рождением нежизнеспособного потомства, снижением продуктивности животных. Возбудители лептоспироза представляют собой извитые, подвижные, грамотрицательные бактерии размером 0,1x6-12 мкм, один или оба конца которых имеют форму крюч­ка.

    Лептоспиры относятся к порядку Spirochetales , семейству Leptospiraceae, роду Leptospira , который содержит два вида: L . interrogans — патогенный вид, L . biflexa— свободноживущие лептоспиры. В настоящее время на основании анализа генома в роде Leptospira выделя­ют 12 видов: L . interrogans , L . kirshneri , L . meyeri , L . noguchii , L . inadoi , L . fainei , L . borgpetersenii , L . santarosai , L . weilii , L . wolbachii , L . alexanderi , L . biflexa и 5 геномовидов, обозначаемых цифрами. По антигенной струк­туре лептоспиры подразделяют на 230 серовариантов, объединенных в 25 серогрупп (таблицы 1, 2).     

  Лабораторная диагностика лептос­пироза основана на результатах бактериологического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование

Материал для исследования. Прижизненно берут кровь и мочу. Кровь для бактериологического иссле­дования берут в фазе лептоспиремии, на 1-7-е сутки болезни при наличии лихорадки. Приблизительно 5 мл крови набирают в стерильные пробирки с 0,5 мл 1%-ного натрия цитрата. Для серологических исследований кровь берут не ранее недели после клинических проявлений болезни или через 60 дней после введения вакцины.

  Мочу собирают в чистую посуду (пробирки, банки и т.д.) и в кратчай­шие сроки подвергают микроскопическому исследованию, при 30-40°С в течение 3 часов, 25-30°С— 4-5 часов, 20-25°С — 6-8 часов, 16-20°С — 10-12 часов. Эффективнее микроскопически исследовать мочу в первые 20-30 минут после взятия, а также нейтрализовать ее N/10 HC1 или N/10 NaOH. Если моча предназначена для получения культур возбудителя и должна быть транспортирована, то рекомендуется разводить ее 1:10 1%-ным сывороточным альбумином круп­ного рогатого скота.

Для посмертной диагностике берут трупы мелких животных, сердце, кусочки паренхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей. Перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спиномозговую жидкость. Если наблюдаются аборты, берут абортированный плод или желудок плода с содержимым и паренхиматозные органы.

Воду из источника для обнаружения лептоспир берут в объеме 1,5-2,0 л в стерильные колбы с ватно-марлевыми пробками.

Патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 ч. в летнее время и 10-12 ч. при условии хранения его в охлажденном состоянии.

Таблица 1 - Основные возбудители лептоспироза у животных

Bergey , 1984)

 

Вид животного	Серогруппы лептоспир
Крупный рогатый скот   Мелкий рогатый скот     Лошадь     Свиньи   Собаки	Canicola, Grippotyphosa, Hebdomadis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Sejroe, Tarrasovi. Grippotyphosa, Hebdomadis, Pomona, Sejroe, Tarrasovi Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi   Canicola, Hebdomodis, Icterohaemorrhagiae, Sejroe, Pomona , Tarassovi Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona

Таблица 2- Лептоспиры, поражающие животных в России

 

Лептоспиры	Вид животных
	Свиньи	Крупный рогатый скот	Мелкий рогатый скот
Основные   Редко встречающие­ся	Pomona , Tarassovi Hebdomadis, Canicola, Gryppotyphosa, Icterohaemorrhagiae	Hebdomadis, Pomona, Tarassovi, Gryppotyphosa Canicola, Icterohaemorrhagiae	Gryppotyphosa, Pomona, Tarassovi Canicola, Icterohaemorrhagiae

Микроскопическое исследование исходного материала. В исследуемом материале лептоспиры обнаруживают в неокрашенном со­стоянии при помощи темнопольной микроскопии, реже — в окрашенных препаратах.

 Темнопольная микроскопия. Для лабораторных исследова­ний применяют сухие системы с увеличением 400-500 раз. Готовят препарат «раздавленная капля». Толщина предметных стекол не должна быть больше 1-1,2 мм, покровных — 0,2 мм, в противном случае препарат не оказывается в фокусе конденсора. Стекла должны быть без царапин, чис­тые, обезжиренные. На верхнюю линзу конденсора помещают каплю дис­тиллированной воды, конденсор поднимают до уровня поверхности пред­метного столика, чтобы вода контактировала с предметным стеклом. В капле исследуют не менее 50 полей зрения.

При оптимальной настройке микроскопа лептоспиры в препарате вид­ны па темном фоне как спиралеобразные, тонкие серебристо-белые нити с Первичными завитками в виде тесно примыкающих друг к другу зерен. Концы лептоспир утолщены и оба или один загнуты, размер клеток 0,1 x 6-25 мкм. В жидкой среде лептоспиры движутся, вращаясь то в одну, то в другую сторону вокруг длинной оси, поступательно перемещаясь незагнутым концом вперед. В вязких средах движение может происходить по типу Волнового, винтового и змеевидного. В препаратах из нативного материала часто могут присутствовать клетки, потерявшие Способность к движению.

Кусочки паренхиматозных органов растирают в ступке с небольшим Количеством физиологического раствора (1:2), центрифугируют для осаждения крупных частиц в течение 10 минут при 3000 об/мин или отстаи­вают 1-2 часа при 4-6°С. Исследованию подвергают надосадочную жидкость. Мочу исследуют сразу после взятия и центрифугирования (10-12 тыс. об/мин, 30 минут).

Нитратную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. об/мин в течение 5 минут, отсасывают надосадочную жидкость, повторно центрифугируют ее в течение 30 минут при 10-15 тыс. об/мин, осадок исследуют. При этом не­обходимо учитывать, что артефактные структуры, напоминающие лептос­пиры (нити фибрина, оболочки эритроцитов и др.), неподвижны.

Приготовление и микроскопия окрашенных препаратов лептоспир. Леп­тоспиры плохо воспринимают красители. Могут быть использованы следу­ющие методы окраски.

Окраска по Ромаповскому-Гимза. Мазки фиксируют спирт-эфиром (1:1) или метанолом — 3 минуты, окрашивают 8-12 часов красителями (0,5 мл краски и 10 мл нейтральной дистиллированной воды). Лептоспиры в пре­парате имеют светло-розовый цвет.

Окрашивание риванолом или аурамином по B . C . Киктенко. Используют для окраски препаратов из культур лептоспир. Тонкий ма­зок фиксируют легким нагреванием, наносят раствор 3%-ной серной кислоты и подогревают мазок в течение 1 минуты, промывают водой. На препарат наносят риванол или аурамин (1:1000), высушивают. Лептоспиры приобретают зеленоватый оттенок (риванол) или золотистый (аурамин) цвет.

Импрегнация серебром по B . Babudieri . Мазок фиксируют жид­костью Руге в течение 1-2 минут, промывают водой, наливают на препа­рат раствор танина и прогревают до появления паров, промывают в про­точной, а затем дистиллированной воде. На несколько секунд на мазок наливают раствор азотнокислого серебра, а затем заменяют раствор на свежий и подогревают до появления коричневой окраски с металлическим отливом, промывают препарат в проточной воде. При микроскопии лептоспиры имеют черный цвет на светло-коричневом фоне.

Жидкость Руге: ледяная уксусная кислота — 1 мл, формалин (40%-ный) —2 мл, дистиллированная вода —100 мл.

Раствор танина: танин — 5 г, фенол — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл.

Раствор азотнокислого серебра: к 1%-му раствору азотнокислого се­ребра в дистиллированной воде добавляют по каплям 10%-ный раствор аммиака до исчезновения первоначально выпавшего осадка и просветле­ния раствора. Раствор хранят в склянке темного стекла.

Импрегнация лептоспир серебром в гистологических срезах по Левадити. Кусочки органов (корковый слой почек, печень) толщиной 0,2-10 мм фиксируют 24-48 часов в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, затем переносят в 96%-ный этанол на 24 часа, выдерживают 3 часа в дистиллированной воде, трех­кратно заменяя ее на свежую.

На следующем этапе материал помещают в 1-3%-ный раствор азотно­кислого серебра на дистиллированной воде на 3-6 суток при 37° С. Мате­риал промывают в дистиллированной воде 2-5 минут, переносят на 2 ми­нуты в небольшое количество раствора редуцирующей смеси и далее в ос­новной редуцирующий раствор (пирогаллоловая кислота — 4 г, формалин чистый — 5 мл, дистиллированная вода — 100 мл) в банке темного стекла, выдерживают в растворе 24-48 часов при комнатной температуре. Реду­цирующую смесь берут из расчета 20-25 мл на кусочек ткани. Длитель­ность экспозиции контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12-16 часов.

При изготовлении срезов материал промывают в дистиллированной воде 1-2 часа. Затем последовательно обрабатывают 96%-ным этанолом 24 часа, новой порцией 96%-ного этанола 24 часа и снова 24 часа свежим спиртом. Далее материал помещают в спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) до опускания кусочков на дно сосуда, затем помеща­ют на ночь в метилсалициловый спирт.

Материал переносят в парафиновую кашу (парафин и ксилол поровну) на 30 минут при 57°С, далее в парафин на 60 минут при 57°С и в свежий парафин при 57°С на 60 минут.

Парафин быстро остужают, вырезают блок с кусочком органа и на­клеивают на деревянный кубик. На сапном микротоме готовят тонкие срезы, наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10-15 минут и заключают под покровное стекло в бальзам. Готовые препараты хранят в темноте.

Микроскопическая картина: лептоспиры — черные, ткань — беловато-желтая. После импрегнации серебром лептоспиры обычно имеют S-образную с 1-2 изгибами или змеевидную форму.

Индикацию лептоспир в исследуемом материале можно проводить ме­тодом флуоресцирующих антител.

Выделение и идентификация лептоспир. Культивирование. Лептоспиры — аэробы, температурный оптимум 28-30°С, рН 7,2 - 7,6, концентрация натрия хлорида в среде — 0,05%, рост на питательных средах замедленный, первичные посевы на жидких питательных средах вы­держивают до трех месяцев. Культуры чаще вырастают через 7-20 дней, редко — через 2-3 месяца.

Первичные посевы материала обычно производят на жидкие питатель­ные среды. Для длительного хранения культур могут быть использованы полужидкие среды, с целью исследования физиологии, антигенной струк­туры — плотные среды.

Кровь высевают в количестве 3-5 капель в 5-7 пробирок с жидкой питательной средой. Посмертно посевы производят из крови сердца, ткани почек (из коркового слоя), печени, у абортированных плодов — также из содержимого желудка. Рекомендуется материал, контаминированный посто­ронней микрофлорой (моча), пропускать через фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и засевать в среды, содержащие 5-флуороурацил в концентрации 200 мкг/мл. Посевы производят пастеровскими пипетками в 3-5 пробирок.

При поддержании лептоспир в лаборатории культуры пересевают пас­теровскими пипетками, причем объем исходной культуры должен состав­лять приблизительно 0,1 объема свежей среды, так как при малой посевной дозе рост бывает замедленным и скудным. Интервал пересевов культур 10-15 суток.

С целью длительного хранения без лиофилизации культуры лептоспир в пробирках заливают вазелиновым маслом, держат в темноте при комнат­ной температуре. В таких условиях лептоспиры сохраняют жизнеспособ­ность до трех месяцев.

 

  Характер роста лептоспир на питательных средах. При размножении в жидких питательных средах лептоспиры практичес­ки не изменяют внешнего вида среды, поэтому наличие роста устанавлива­ют при помощи исследования среды из всех засеянных пробирок в препарате «раздавленная капля» методом темнопольной микроскопии через каж­дые 3-5 дней на протяжении трех месяцев.

В полужидких питательных средах рост в виде интенсивно опалесцирующего кольца обнаруживается невооруженным глазом на расстоянии 3-5 мм ниже поверхности среды. Культуры на полужидких средах выращива­ют для длительного хранения.

На плотных питательных средах (с 1% агара, 10% сыворотки кро­ви) лептоспиры образуют колонии S-, О-, R-формы. Колонии патоген­ных и сапрофитных лептоспир могут быть разнообразными: росинчатыми, круглыми диаметром 2-4 мм, кольце­видными, астровидными, с сосочковидным центром, неправильной фор­мы. Различает три фазы развития колоний: пери­од поверхностного роста, период внедрения в агар, период глубокого врастания. В конечной фазе могут формироваться крупные до 3-4 см в диаметре колонии. Колонии патогенных лептоспир вырастают на 6-20-е сутки, чаще на 7-8-й день, сапрофитные — 3-6-й день. Колонии S-формы — круглые, прозрачные, дисковидные, с тонкой периферий­ной каймой. Колонии R-формы имеют неправильную хлопьевидную конфигурацию.

Для очистки загрязненных культур рекомендуется осуществлять фильт­рацию через пластины марки «СФ» с последующим засевом фильтрата в жидких питательных средах.

Также может быть использован дробный рассев на поверхность плот­ных питательных сред в чашках Петри. Субкультуры из колоний отвивают на жидкие среды.

Свежевыделенные штаммы лептоспир можно сохранять без пересевов в течение года, если получено хорошее накопление, а культура разлита по ампулам, которые запаивают и хранят при 20° С. Культуры в пробирках, под слоем вазелинового масла, в темноте, при комнатной температуре со­храняют жизнеспособность до трех месяцев. Аналогичным образом на среде Терских удобно со­хранять лептоспиры до 5- 8 недель.

 

  Морфология клеток лептоспир в культуре. Морфология лептоспир в культуре и исходном материале различий не имеет. Препарат из культур (помимо темнопольной микроскопии в живом состоянии) можно, в случае необходимости, окрашивать, хотя лептоспиры слабо воспринимают красители.

В колониях на плотных питательных средах через 10-14 суток куль­тивирования лептоспиры подвижны и хорошо делятся, позднее в цент­ре колонии находят густо переплетенные мертвые лептоспиры, а по пе­риферии — молодые, делящиеся.

 

Дифференциация патогенных и сапрофитных лептоспир по

            биологи­ческим свойствам

В практической работе существует задача разграничения паразитичес­ких ( L . interrogans ) и сапрофитических ( L . biflexa ) лептоспир. Для этой цели используют следующие критерии (табл. 3).

 

Таблица 3 - Дифференциация патогенных и

Сапрофитных видов лептоспир

 

Признаки	L. interrogans	L. biflexa
Патогенность	+	-
Рост при температуре 13° С	-	+
Иигибиция роста 8-азагуанином	+	-
(225 мкг/мл)
Превращение клеток в 1М растворе	+	-
NaCl в округлые формы при 20-30° С
Выделение липазы	некоторые серовары	+
Содержание Г + Ц в ДНК, моль%	35,3-39,9	38-41

Серологическая идентификация лептоспир. Выделенные штаммы первоначально идентифицируют в реакции микроагглютинации на уровне серологических групп, а далее в пределах уста­новленной серогруппы определяют серовар. Техника постановки реакции микроагглютинации при определении серогрупповой принадлежности леп­тоспир изложена в соответствии с «Методическими указаниями по применению групповых агглютинирующих лептоспирозных сывороток». Реакцию применяют для контроля диагностических штаммов лептоспир с сыворотками первого набора и выделенных штаммов с сыво­ротками второго набора. В качестве агглютиногена используют живые 5-10-суточные культуры в жидких питательных средах с накоплением 70-100 лептоспир в поле при увеличении 20x10x1,5.

В России применяют групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворот­ки в виде двух наборов (1-й: серогруппы Гриппотифоза, Помона, Иктерогеморрагия, Каникола, Тарассови, Батавия, Гебдомадис, Сейро, Мини, Пирогенес, Лутумпалис, Баллум, Аустралис, Яваника, Циноптери; 2-й: вышеперечисленные сыворотки, а также Целледони, Панама, Андамана, Семаранга, Шермани).

На физиологическом растворе готовят разведения диагностической сы­воротки 1:50, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16 000, 1:32 000. К 0,1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 0,1 мл исследуемой куль­туры. Контроль: 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл культуры леп­тоспир. Смесь компонентов выдерживают при 30-37°С в течение часа.

Результат учитывают путем темнопольной микроскопии препарата «раз­давленная капля». Оценку проводят в крестах: + + + + —агглютинирова­ны 100% клеток, + + + — агглютинированы 75% клеток, + + — агглютини­рованы 50% клеток, + — агглютинированы 25% клеток, (—) — агглютина­ция отсутствует. Исследуемую культуру относят к серологической группе лептоспир, с сывороткой против которой она дает реакцию на два-четыре креста до 50-100% ее титра.

После установления серогрупповой принадлежности штамма проводят аналогичное исследование со штаммами и антисыворотками к ним, пред­ставляющими все серотипы данной серогруппы.

Если в РМА не удается получить четких указаний на принадлежность штамма к определенному серовару, то применяют реакцию перекрестной адсорбции.

Техника иммуноадсорбционного анализа. Необходимо приготовить им­мунную сыворотку на изучаемый штамм. С этой целью проводят гиперим­мунизацию кроликов внутривенно изучаемой культурой лептоспир, содер­жащей 70-100 клеток в поле зрения (х 400) по схеме 1,2 и 2 мл с интерва­лом в трое суток и 3 мл с интервалом в пять суток. На девятые сутки после заключительной инъекции пробы сыворотки крови исследуют в РМА, тит­ры обычно составляют 1:30 000 и более. Для стандартизации условий опы­та иммунные сыворотки разводят до получения единого титра — 1:3000 (в РМА с формалинизированным антигеном) при интенсивности реакции в этом титре не более чем два креста.

При получении антигенов лептоспиры культивируют во флаконах ем­костью 100-250 мл со средой Ферворта-Вольфа при 30° С в течение 4-7 суток до накопления 80-150 микробных клеток в поле зрения (х 400). Леп­тоспиры инактивируют формалином (0,5%), осаждают центрифугировани­ем (10 000 об/мин, 20 минут), затем осадок из флаконов объединяют и цент­рифугируют повторно (10 000 об/мин, 10 минут). К осадку лептоспир, полу­ченному из 100 мл исходной культуры, добавляют 0,1 мл физиологическо­го раствора, суспендируют и добавляют еще 0,8 мл физиологического ра­створа. В этот объем антигена вносят 0,1 мл антисыворотки со стандарт­ным титром (1:3000). Стаканы со смесью компонентов, во избежание испа­рения жидкости, закрывают резиновыми пробками и выдерживают при 37°С или при 2-3°С в течение 24 часов. Далее смесь центрифугируют (10 000 об/мин, 10 минут), надосадочную жидкость осторожно (не взмучивать!) отсасыва­ют. Она представляет из себя адсорбированную сыворотку. Эту сыворотку в разведении 1:30 проверяют в РМА с формалинизированной культурой-адсорбентом на наличие остаточных антител (антител не должно быть!). В случае необходимости адсорбцию повторяют. При отсутствии антител к лептоспире-адсорбенту сыворотку исследуют в РМА с гомологичными и гетерологичными антигенами. С указанной целью адсорбированную сыво­ротку разводят 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, 1:3000, принимая во внимание, сыворотка в процессе адсорбции уже была разведена 1:10 (0,9 мл антигена + 0,1 антисыворотки). Титр стандартной сыворотки (1:3000) принимают за 100%. Соответственно в процентах выражают каждое разведение этой сыворотки и в виде процентов изображают результаты исследования. Если эталонный штамм полностью (или более чем на 90%) адсорбирует антитела из сыворотки против изучаемого штамма, то изучаемый штамм считают идентичным эталону. Серогруппу или серовар можно установить, используя моноклональные антитела соответствующей специфичности.

Возможна серологическая идентификация лептоспир методом флуоресцирующих антител в исследуемом материале или в культурах на уровне вида.

В нативном материале и в культуре лептоспиры можно идентифициро­вать на уровне вида, серогруппы и серовара при помощи ПЦР.

   Биопроба. Проводят с целью выделения культур лептоспир из исследуемого материа­ла, определения патогенных свойств культуры или освобождения ее от по­сторонней микрофлоры.

Для заражения используют суспензию паренхиматозных органов (поч­ки, печень) от абортированных плодов, сперму, кровь, мочу. Кровь целесо­образно брать на стадии лихорадки. Позднее можно исследовать первую порцию утренней мочи. Паренхиматозные органы измельчают в ступке со стерильным физиологическим раствором, после отстаивания используют надосадочную жидкость. Любым материалом лабораторных животных за­ражают сразу же после его получения.

Заражают кроликов-сосунков (10-20-дневный возраст), молодых мор­ских свинок (масса не более 200 г), золотистых хомячков (20-30-дневный возраст), сусликов, белых и серых мышей. Крольчатам материал вводят подкожно или внутрибрюшинно в дозе 2-3 мл, хомякам — 0,5-1,0 мл. Морские свинки наиболее чувствительны к лептоспирам Icterohaemorrhagiae , несколько меньше — к Pomona и малочувствительны к другим лептоспирам.

За животными наблюдают в течение 15 суток, в случае гибели под­вергают бактериологическому исследованию, при отсутствии гибели часть животных убивают и исследуют через 4-5 суток, остальных — через 14-16 суток. В последнем случае исследуют сыворотку крови, начиная с разведения 1:10 в РМА. Заключение о результатах биопробы делают на основании показаний серологической реакции.

Для проверки патогенных свойств выделенных лептоспир заражают раз­личными дозами (0,1-1,0 мл) 5-7-дневной бульонной культуры внутрибрюшинно крольчат и золотистых хомячков (0,1-1,0 мл). Штаммы, вызы­вающие гибель животных от дозы 0,1 мл, оценивают как высоковирулент­ные, 1,0 — слабовирулентные.

Серологическая диагностика. Серологическую диагностику в основном осуществляют при помощи реак­ций микроагглютинации (РМА), иммуноадсорбции (РИА), ELISA.

Реакция микроагглютинации. В качестве антигенов используют 5-15-дневные живые культуры в жидкой питательной среде с накоплением 70-100 клеток в поле зрения при увеличении микроскопа 20x10x15, более густые — разводят питательной средой до указанной концентрации. Культуры определенных серогрупп лептоспир диагностическим лабораториям предоставляет Всероссийский научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертифи­кации ветеринарных препаратов.

Таблица 4 - Штаммы лептоспир, используемые

Для постановки РМА

Серогруппа	Серовар	Рекомендуемые штаммы
Pomona	Pomona	Pomona
Tarassovi	tarassovi	Perepelicin (Mitis Jjhson)
Grippotyphosa	grippotyphosa	Moskva V (Valbuzzi)
Hebdomadis	kabura (borincana, hebdomadis)	Kabura (HS-22, hebdomadis)
Sejroe	polonica (sejroe, wolffi, hardjo)	493 Poland (M-84, 3705, hardjoprajitno)
Mini
Jcterohaemorrhagiae	szwajizak	Szwajizak
Canicola	copenhageni (icterohaemorrhagiae)	M-20, Waijnberg (RgA)
Bataviae	canicola	Hond Utrecht IV
Javanica	djatzi (bativiae)	HS-26 (Van Tienen)
Australis	poi (javanica)	Poi (Veldrat Bataviae 46)
Autumnalis	australis (brtislava)	Ballico (lez Bratislava)
Ballum	autumnalis (rachmat)	Akijami A (Rachmat)
Pyrogenes	balum (castellonis)	Mus 127(CaseteUon3)
Cynopteri	pyrodenes	Salinem
Panama	cynopteri	Vleermuis 3568 (3522C)
Cclledoni	panama	CZ-214-K
Shermani	celledoni	Celledoni
Djasiman	shermani	LT-821
Sarmin	djasiman	Djasiman
Louisiana	sarmin	Sarmin
Ranarum	louisiana	LSU-1945
Manhao	ranarum	ISF
	manhoa	L105

 

 Культуры лептоспир, используемые в качестве антигенов при определе­нии этиологической структуры и обследовании импортируемого скота приведены в таблице 4. В хозяйствах с установленной этиологией и при транспортировке животных в пределах страны используют культуры серогрупп Pomona , Tarassovi , Canicola , Hebdomadis , Sejoroe , Grippotyphosa , Icterohaemorrhagiae .

Сыворотки крови исследуют в разведениях 1:100, 1:500, 1:2500 с уче­том объема антигена, при необходимости определяют предельный титр. Раз­веденную сыворотку на 0,85%-ном растворе натрия хлорида разливают по 0,1 мл в различное количество лунок планшеты в зависимости от числа используемых антигенов. Затем в лунки вносят по 0,1 мл антигена. Контро­лем является культура лептоспир + физиологический раствор (агглютина­ции не должно быть). Компоненты перемешивают встряхиванием, выдер­живают час при 30 -37°С, затем учитывают результат путем микроскопии препарата из содержимого каждой лунки при увеличении 20x10. Капли не покрывают покровным стеклом и наносят на предметное стекло бактерио­логической петлей диаметром 3 мм.

Результат оценивают по следующим критериям: (+ + + +) — агглюти­нированы 100% лептоспир; (+ + +) — агглютинированы 75% лептоспир; (+ +) — агглютинированы 50% лептоспир; (+) — агглютинированы 25% лептоспир; (—) — агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в образовании конгломератов из 3-5 до нескольких десятков лептоспир при возможном лизисе клеток в малых разведениях сыворотки. Как поло­жительный результат оценивают агглютинацию минимум на 2 креста.

Животных с титром РМА 1:50 у невакцинированных, 1:100 и выше у вакци­нированных оценивают как зараженных или возможных лептоспироносителей. Если в РМА при однократном исследовании реагирует положительно более чем 20% обследованных животных, то хозяйство признают неблагополучным по лептоспирозу. Положительные реакции с антителами Autumnalis , Cynopteri , Bataviae , Pyrogenes , Australis рассматривают как серогрупповые, поскольку лептоспиры указанных серогрупп обычно у сельскохозяйственных животных не обнаруживаются. Их признают возбудителями только в случае выделения чис­той культуры или положительной РМА.

Возбудителями лептоспироза признаются лептоспиры серогруппы, к ко­торой антитела выявлены в большем титре. При положительной РМА с лептоспирами необычных серогрупп проводят повторное исследование жи­вотных через 10-12 суток в РМА.

В США титр РМА 1:100 рассматривают как основание для подозрения в заболевании животного, 1:200 и более — как положительный результат, 1:800 и более — как показатель активной инфекции.

При получении равных титров сыворотки с лептоспирами нескольких серогрупп или высоких титров к лептоспирам, ранее неизвестным как воз­будители у с/х животных, для выяснения их этиологической роли прибегают к иммуноадсорбционному анализу. Техника иммуноадсорбционного анализа изложена ранее применительно к серологической идентификации выделенных культур лептоспир.

Малахов Ю.А. и соавт. (1986) рекомендуют проводить иммуноадсорбцию исследуемых сывороток по следующей схеме. В качестве адсорбента применяют 5-7-суточные культуры, выращенные в жидкой питательной среде, инактивированные 0,3%-ным формалином в течение 10-12 часов, осажденные центрифугированием в течение 30 минут при 10000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0,9 мл физиологического раствора, смешивают с 0,1 мл исследуемой сыворотки, выдерживают 48 часов при 1-5°С, цент­рифугируют, надосадочную жидкость (адсорбированную сыворотку) ис­следуют на наличие антител к штамму-сорбенту, а далее исследуют со все­ми штаммами в РМА, с которыми сыворотка реагировала до адсорбции. Антитела к возбудителю из сыворотки при абсорбции гетерологичными лептоспирами не удаляются.

 Питательные среды для культивирования лептоспир.  Фосфатные буферные растворы. Маточные растворы: а) КН₂Р0₄ — 9,078 г растворяют в 1000 мл дис­тиллированной воды; б) Na₂HP0₄x 2Н₂0 — 11,876 г растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Растворы хранят при 2 -4°С до 30 суток. Рабо­чий буферный раствор готовят следующим образом: 79 мл раствора Б сме­шивают с 21 мл раствора А и 900 мл дистиллированной воды. Контролиру­ют рН буфера и в случае необходимости подкисляют однозамещенным фос­форнокислым калием или подщелачивают двузамещенным фосфорнокис­лым натрием до рН 7,2 -7,4. Готовый раствор стерилизуют при 120°С в течение 30 минут.

Водно-сывороточная среда. Разлитый во флаконы фосфатный буферный раствор (рН 7,2 -7,4) автоклавируют при 115°С 30 минут. К охлажденному буферному раствору добавляют 5 -10% инактивированной при 56 -58°С в течение 1 часа сы­воротки крови кролика или барана, фильтруют через фильтр Зейтца и раз­ливают в пробирки. Для проверки на стерильность среду выдерживают при 37° С в течение 3 -5 суток.

  Среда Ферворта в модификации W . Wolff (1954). 1)Растворяют 1 г пептона в 1 л дистиллированной воды и кипятят. 2) Добавляют 200 мл раствора Рингера и вновь кипятят. 3) Добавляют 100 мл фосфатного буфера рН 7,2 и кипятят. 4) Добавляют N-раствор фос­форной кислоты (2 мл). 5) После пятиминутного кипячения смеси и охлаж­дения ее фильтруют через бумажный фильтр и вновь кипятят 30 минут. 6) Раз­ливают в пробирки по 3 мл, прогревают пробирки 30 минут при 100°С. 7) Добавляют в каждую пробирку по 0,3 мл кроличьей сыворотки, содержа Щей небольшую примесь гемоглобина (гемолизированных эритроцитов). 8) Инактивируют 30 минут при 56°С в водяной бане. 9) Проверяют стерильность: выдерживают среду в термостате при 37° С в течение 24 часов.

   Полужидкая среда Флетчера. К1000 мл дистиллированной воды добавляют 2 г агара и кипятят 30 минут. Затем разливают по 5 мл в пробирки и автоклавируют при 0,8 атм 30 минут. После охлаждения в каждую пробирку вносят по 0,5 мл стериль­ной сыворотки крови кролика или барана, инактивируют при 56-58° С 30 минут. Проверяют на стерильность в течение 3 -5 суток при 37°С.

Среда Кортхофа. Бидистиллированной воды — 500 мл, пептона Витте — 400 мг, натрия хлорида — 700 мг, NaHCО₃ — 10 мг, калия хлорида — 20 мг, кальция хло­рида — 20 мг, КН₂РО₄ — 90 мг, Na₂HPО₄x 2Н₂О — 480 мг.

Раствор прогревают 20 минут при 100°С, фильтруют через бумажный фильтр, прогревают в течение 30 минут при 100°С. После охлаждения до­бавляют 8% свежей кроличьей сыворотки. Разливают в пробирки по 8 мл. Прогревают в водяной бане при 56° С в течение 1 часа.

   Среда Стюарта. D-аспарагина (М/10) — 2 мл, Н₄С1 (М/10) — 10 мл, MgCl₂ (М/10) — 4 мл, NaCl (М/10) — 66 мл, глицерина — 1 мл, водного раствора фенола красного (0,02%) — 10 мл, дистиллированной воды — 91 мл.

Смесь кипятят 30 минут, добавляют 16 мл фосфатного буфера (рН 7,6) и вновь прогревают при 100°С в течение 1 часа. Охлаждают и добавляют 5-10% стерильной кроличьей сыворотки. Разливают асептично в пробирки по 4-5 мл в каждую и прогревают в водяной бане при 60°С в течение 1 часа.

Цветная питательная среда для определения ферментации углеводов по А.С. Самедову. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,7 мг 10% экстракта пекарских дрожжей и раствор стерилизуют в течение 20 минут в автоклаве. Затем к этой смеси добавляют 250 г одного из углеводов и устанавливают рН 7,0-7,2. После этого добавляют 1 мл реактива Андредэ. Готовую сре­ду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 3-5 мл и вто­рично стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 минут. Перед посевом лептос­пир в эту среду добавляют инактивированную кроличью сыворотку из рас­чета 5% к объему среды (рН среды 7,4-7,6). Посевы заливают вазелино­вым маслом. В случае ферментации углеводов среда окрашивается в свет­ло-малиновый цвет.

Плотная среда Кокс. В90 мл дистиллированной воды растворяют 1 г агара Дифко, 0,2 г триптозофосфатного бульона Дифко, автоклавируют, охлаждают до 50°С, до­бавляют 10 мл стерильной сыворотки крови кролика и 1 мл 5 -10%-ного раствора гемоглобина. Раствор гемоглобина готовят путем лизиса одного объема эритроцитов в 20 объемах дистиллированной воды и фильтрования через фильтр Зейтца. В среде устанавливают рН 7,5; прогревают в водяной бане при 56°С 30 минут, разливают ее в чашки Петри.

Среда Канарейкиной С. и Черкулан П. В 90 мл дистиллированной воды растворяют 50 мл натрия хлорида, 1 г агара Дифко, 2,4 мл триптического перевара Хоттингера. Смесь кипятят 3-5 минут, добавляют 10 мл фосфатной смеси (см. выше), вновь кипятят, устанавливают рН, автоклавируют при 120°С в течение 15 минут. Далее смесь охлаждают до 50°С, добавляют 10 мл инактивированной кроличьей сыворотки и 5-10% гемоглобина (см. выше).

Среда Еллингаузена и Куллода

Раствор «а»: Н₄С1 — 5,35 г, MgCl₆KH₂0 — 3,72 г, NaCl — 38,50 г, ди­стиллированная вода — 1л; раствор «б»: Na₂HP0₄ — 16,6 г, КН₂Р0₄ — 2,172 г, дистиллированная вода — 1 л. К 700 мл дистиллированной воды добавляют 50 мл раствора «а» и 40 мл раствора «б». Затем добавляют L-цистин — 180 мг, ZnSО₄ — 3,2 мг, CuSО₄ x 5Н₂О — 2,4 мг, FeSО₄ х 7Н₂0 — 40 мг. Смесь встряхивают и фильтруют. Вносят витамин В₁₂ — 160 гамм и тиамин-НС1 —160 гамм. Добавляют дис­тиллированной воды до окончательного объема среды (1 л). Затем раствор стерилизуют при 121°С 15 минут. После охлаждения добавляют 20%-ный олеино-альбуминовый комплекс (ОАС) — 1% к объему среды. Он может быть заменен V фракцией бычьего альбумина (1%) и твином-80 (0,1%).

---

Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 344; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!