Состав сред для оттаивания и разбавления спермы
| Наименование компонентов | БТС | Японская | ИНРА- ИТП | ОЛЕП | ВИЖ (В.П. Ко- нонов, А.Г. На- рижный, 1981) | ВНИИРГЖ (Л. Мороз и др., 1985) |
| Глюкоза | 37 | 5 | 3,06 | 30 | ||
| Фруктоза | — | 0,5 | — | 5 | — | 25 |
| Инозит натрия | — | 0,5 | — | — | — | 15 |
| Цитрат натрия | 6 | — | 20 (24, 28) | — | 4 | 2,76 |
| Калий лимонно- кислый | — | — | — | — | — | 0,65 |
| ЭДТА | 1,25 | — | 3,07 | — | 1 | — |
| Пируват натрия | — | — | — | 5 | 10 | 2,20 |
| Магний сернокис- лый | — | — | — | — | — | 0,24 |
| Унитиол | — | — | — | — | — | 0,21 |
| Натрия бикарбонат | 1,25 | — | 2,1 | 0,84 | _ | — |
| Калия хлорид | 0,75 | — | 0,4 | 1,2 | — | — |
| Натрия хлорид | — | — | — | 3,5 | — | — |
| Кальция хлорид | — | — | — | 0,06 | — | — |
| Магния хлорид | — | — | — | 0,665 | — | — |
| Желток (мл) | — | 2 | — | — | — | — |
| Тиаминпропилди- сульфид- гидрохлорид (мг) | — | 0,2 | — | — | — | — |
| Вода дистиллиро- ванная (мл) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| Пенициллин- калий, ME | — | 1000 в 10 мл 1%-го фос- фатного бу- фера | 1000000 | 1000000 | — | — |
| Дигидрострепто- мицин | — | — | 1,0 | 1,0 | — | — |
| Сульфаниламид | — | — | 3,0 | — | — | — |
Сперму в замороженных гранулах выдерживали в пенопла- стовой коробке в течение 3 мин, после чего ее оттаивали в ста- кане или тефлоновой сковороде, где содержалось 12 мл одной из синтетических сред для оттаивания при 50°С (табл. 180). Ус- тановлено, что наилучшая подвижность и сохранность акросом были при оттаивании в БТС среде. Было также выявлено, что сохранность акросом выше при оттаивании замороженных гра- нул в растворах тефлоновой сковороды. По данным других ис- следователей, оплодотворяемость при оттаивании концентриро- ванных гранул спермы в плазме и ОЛЕП среде была выше, чем при оттаивании в изотоническом растворе глюкозы (53 и 57 %), а если в качестве среды для оттаивания использовали БТС, то была получена оплодотворяемость 47 %.
|
|
|
Для замораживания спермы по белтсвильскому методу ис- пользовали одну среду (сахароза 50 г, трис 0,6 г, цитрат натрия 3,0 г, аммония сульфат 2 г, лимонная кислота 0 г, глицерин 40 мл, желток 50 мл, вода 1000 мл) и вторую среду (сахароза 21 г, трис 23 г, цитрат натрия 3 г, лимонная кислота 12 г, аммония цитрат 2,4 г, глицерин 40 мл, желток 50 мл, вода 1000 мл). Сперму в БТС среде оттаивали. Оплодотворяющая способность маток при осеменении спермой, замороженной в 1-й среде, бы- ла 50 и 61 %, во 2-й среде – с многоплодием 5,5 и 7,4 поросят.
В целях повышения эффективности искусственного осеме- нения свиноматок Я. Брутгансом был испытан отечественный препарат ІІ-дезоксипростагландин Е1 (ДПГЕ). Выяснено, что препарат ДПГЕ повышает выживаемость спермиев вне орга- низма, усиливает моторику матки и соответственно продвиже- ние спермиев в половых путях и ускоряет наступление овуля- ции яйцеклеток. Н. Корбан и др. (1984) применили препарат ДПГЕ в концентрации 5,0 мкг/мл для глубокозамороженной спермы, который повышает подвижность и выживаемость по- ловых клеток на 16,7 %, сохранность акросом – на 7 % и опло- дотворяющую способность маток – на 4,6 %.
|
|
|
Эффективное воздействие ДПГЕ на сперму, по-видимому, объясняется способностью простагландинов регулировать про- ницаемость фосфолипидных мембран и других субклеточных структур половых клеток.
Таким образом, приведенные материалы свидетельствуют об отсутствии единой технологии оттаивания спермы и среды для ее оттаивания.
Физиологические аспекты использования глубокозамо- роженной спермы (действие плазмы спермы на выживаемость спермиев в половых путях свиноматок). Установлено, что эф- фективность осеменения оттаянной спермой после ее замора- живания в большей степени зависит от физиологического со- стояния свиноматок, чем от использования свежеполученной спермы. Незначительное отклонение среды от нормы в половых путях самок понижает живучесть оттаянных спермиев. Уста- новлено, что через 8 ч после искусственного осеменения свеже- взятой и замороженной, а затем оттаянной спермой число поло- вых клеток в яйцеводах и в краниальных участках половых пу- тей не различалось. Однако через сутки их число после осеме- нения свиноматок свежевзятой спермой было значительно больше, чем после осеменения оттаянной спермой после ее за- мораживания. Поэтому мертвые спермии в половых путях сви- номаток быстрее подвергаются фагоцитозу, чем живые. Кроме того, опыты Б. М. Вельможного (1974) также показывают, что половые клетки в оттаянной сперме значительно быстрее поги- бают в половых путях самок, чем в свежеполученной.
|
|
|
Живучесть оттаянной спермы зависит от наличия в ней ес- тественной плазмы. Через 1 ч после осеменения свиноматок в половых путях обнаруживают большое число спермиев, отта- янных в среде без плазмы. При оттаивании спермиев в естест- венной плазме через 4 ч их обнаруживают еще больше, чем от- таянных без нее. Кроме того, через 4 ч после осеменения отта- янной спермой без плазмы половые клетки не обнаруживают в верхней третьей части яйцевода, а при введении с естественной плазмой их бывает достаточно для плодотворного осеменения.
Выживаемость спермиев в половых путях маток, по- видимому, можно объяснить стимулирующим действием плаз- мы на моторику матки, так как выживаемость спермиев увели- чивается при продвижении их к верхушкам рогов матки и быва- ет максимальной (до 72 ч) в маточно-яйцеводном сочленении. Однако данные других исследователей показывают, что плазма спермы хряка подавляет моторику матки.
|
|
|
При введении свиньям спермы без плазмы сократительная активность матки не подавляется, что способствует ускоренно- му их продвижению. Однако живучесть введенных в половые пути спермиев без плазмы ниже, чем с плазмой. Позднее было
установлено, что спермии в большем числе достигают верху- шек яйцеводов, если они были введены с плазмой спермы, чем без нее и при условии их введения в верхушку рога матки. Это, возможно, связано с тем, что нативная плазма способствует ре- лаксации маточно-яйцеводного сочленения и продвижению спермиев в яйцевод.
Проведенные исследования К. Larsson et al. (1976) показали, что действие депротеинизированной и цельной плазмы на оп- лодотворяемость оттаянной спермы хряка аналогичное. Однако связи спермиев с белками, важное значение которых при кон- такте спермиев с организмом самки дают основания сомневать- ся в непричастности белков к этому механизму.
Спермии при взаимодействии с секретами добавочных по- ловых желез адсорбируют на своей поверхности белковые ком- поненты. При разбавлении спермы могут быть удалены белки, которые были присоединены физико-химическим путем, и, по- видимому, они частично удаляются, так как оттаянные спермии адсорбируют белковые факторы из плазмы спермы.
R. H. F. Hunter (1973), изучая капацитацию спермиев хряка, установил, что обволакивающие плазменные факторы в поло- вых путях самок для обеспечения оплодотворяемости должны быть удалены ферментативным путем, и это лишает половые клетки защиты от фагоцитоза (H. D. M. Hunter, 1977). По- видимому, плазма спермы необходима для защиты спермиев в половых путях свиней от фагоцитов.
R. H. F. Hunter (1978) установил, что задержку оплодотво- ряемости спермиев почти на 2 ч при инкубации в половых путях свиней вызывают секреты каудальной части хвоста эпидидими- са, то есть декапацитирующий фактор в плазму спермы вводится лишь с содержимым эпидидимиса. Значение эпидидимального фактора заключается в стабилизации мембран, необходимой для выживания спермиев при прохождении половых путей самки.
Использование биологически активных веществ на ре- зультаты осеменения свиней. Для повышения эффективности искусственного осеменения свиней используют простагланди- ны, гормональные и нейротропные препараты, действующие на моторику матки с целью ускорения продвижения спермиев к краниальным участкам половых путей. При осеменении свиней свежеполученной спермой выявлено положительное влияние
добавки окситоцина, который повышает оплодотворяемость при снижении числа спермиев в дозе. Применение карбохолина при искусственном осеменении маток замороженной спермой не оказывало существенного влияния на оплодотворяемость: было получено 50 % оплодотворения, а в контрольной – соответст- венно 41,6 % (без карбохолина). Наряду с данными о положи- тельном действии окситоцина имеется и некоторое противоре- чие – это когда окситоцин эффективен только при неудовлетво- рительных условиях содержания, то есть при скученности жи- вотных или при подавлении стрессовыми факторами естествен- ного окситоцинового рефлекса.
Причины противоречий были устранены после того, как было выяснено, что действие окситоцина зависит от содержа- ния в крови эстрогенов. При высокой их концентрации оксито- цин вызывает антиперистальтические сокращения матки, а при низкой концентрации – перистальтические сокращения. Если содержание эстрогенов в организме при осеменении снижено, то окситоцин способствует перистальтическим сокращениям матки, что ведет к выбросу введенной спермы.
Зависимость результатов осеменения от времени введе- ния спермы и овуляции. Оплодотворяемость свиней от отта- янной спермы зависит от срока введения спермы до начала ову- ляции. Свинкам в течение 3 недель скармливали препарат айма- ке с последующим введением СЖК и ХГ. Через 37–39 ч после введения ХГ 23 свинки были осеменены оттаянной спермой, но через 48 ч после введения спермы у 11 из них были обнаружены оплодотворенные яйцеклетки. В следующем опыте, при осеме- нении свиноматок, было получено 58,3 % опоросов при много- плодии 8,5 поросенка. При инъекции ХГ до осеменения оттаян- ной спермой за 37–39 ч и 29–30 ч было получено соответствен- но 20 и 0 % опоросов.
Предполагается, что овуляция наступает через 39–42 ч по- сле введения ХГ и длится 1 ч. Для изучения действия на резуль- таты осеменения разных сроков от введения замороженной спермы до овуляции были проведены специальные опыты. Пер- вое осеменение маток проводили через 25, 30, 35 и 40 ч после введения ХГ, а второе – через 5 ч после первого осеменения от- таянной спермой после ее замораживания по белтсвилскому ме- тоду. Было установлено, что процент оплодотворенных яйце-
клеток не выявил заметных различий в зависимости от этих сроков, а число оплодотворенных яйцеклеток от первого осеме- нения не отличалось от числа яйцеклеток, оплодотворенных от второго осеменения. От инъекции ХГ до осеменения через 2, 6, 12, и 18 ч процент оплодотворенных яйцеклеток составил, соот- ветственно 53, 49, 33 и 9.
Следовательно, результативность осеменения маток глубо- козамороженной спермой зависит от интервала между введени- ем спермы и овуляцией, который должен быть не более 6 ч. Кроме того, при использовании замороженной спермы важное значение необходимо придавать точности выборке маток, нахо- дящихся в состоянии охоты, условиям кормления, содержания и другим факторам.
Эффективность нетрадиционных методов осеменения свиней. Ученые установили зависимость оплодотворяемости замороженной спермой от времени достижения его краниаль- ных участков половых путей. Если ввести оттаянную сперму в яйцевод за 4–6 ч до наступления овуляции, оплодотворяемость составит 83,5 %, за 20 дней – 38 %. При осеменении 114 свиней в рога матки было извлечено 4 оплодотворенных яйцеклетки. Эти экспериментальные сведения показывают, что чем быстрее спермии проникают в яйцевод, тем выше вероятность оплодо- творения. Однако было выявлено, что маточно-яйцеводное со- членение открывается лишь за 2 ч до наступления овуляции.
В дальнейших исследованиях отрабатывались отдельные элементы совершенствования хирургического метода осемене- ния с применением замороженной спермы. В следующем опыте получен высокий процент опоросов после осеменения хирурги- ческим путем спермой, сохраненной в жидком азоте 2,5 года: было получено 90,9 % опоросов при многоплодии 6,1 поросен- ка.
В исследованиях других ученых было выявлено, что после внутриутробного осеменения свиней опоросилось 50 % при од- ном методе замораживания и 40 % – при другом, а после церви- кального введения спермы – 35 и 30 % соответственно. Следо- вательно, при совершенствовании метода замораживания спер- мы эффективность цервикального метода осеменения прибли- жается к результатам хирургического. Преимущество хирурги- ческого метода осеменения заключается в минимальном числе
спермиев, требуемых для плодотворного осеменения. Поэтому хирургический метод осеменения должен быть использован для получения потомства от высокопродуктивных производителей. С использованием хирургического метода осеменения одним эякулятом производителя можно осеменить до 1000 свиноматок с высоким процентом оплодотворяемости после синхронизации овуляции.
Зависимость результативности осеменения от кратности выявления свиноматок с рефлексом неподвижности. Опло- дотворяющая способность свиноматок при использовании за- мороженной спермы зависит от совпадения времени осемене- ния и овуляции и числа осеменений в одну охоту. В опытах на поголовье из 20 осемененных маток не установлено различий в оплодотворяющей способности в связи с применением одно- кратного или двукратного осеменения в одну охоту. В после- дующих исследованиях учеными установлено, что после одно- кратного осеменения супоросность составила 62,5 % и двукрат- ного – 66,6 % (супоросность определяли с помощью убоя маток на 20–49 дн после их осеменения). Использование однократно- го и двукратного осеменения маток оттаянной спермой в одну охоту было получено 52 и 54,1 % опоросов, а при осеменении свежевзятой спермой – соответственно 75 и 86,6 %.
При двукратном выявлении свиней, находящихся в охоте, и двукратном осеменении через 12 и 24 ч из 65 животных опоро- силось 28 (42,4 %) при средней величине гнезда 9,9 поросенка, а при однократной выборке в сутки и двукратном осеменении че- рез 0 и 24 ч было получено 33,3 % опоросов и 8 поросят в гнезде. Результативность осеменения свиней в зависимости от числа вводимых им спермиев. Есть данные, что разная кон- центрация подвижных половых клеток в зоне замороженной спермы 4,6 и 9,2 млрд не способствует повышению результа- тивности осеменения. Однократное осеменение маток оттаян- ной спермой с содержанием в дозе 1,25, 2,5 и 5 млрд подвиж- ных половых клеток способствует получению 50, 50 и 55,5 % опоросов, а при разделении числа половых клеток на 2 дозы и двукратном осеменении – соответственно 37,5, 37,5 и 87,5 % опоросов. Эти данные убедительно показывают, что необосно- ванное повышение числа спермиев в дозе при глубоком замо- раживании не способствует их выживаемости так же, как и
применение двукратного введения спермы в охоту вместо одно- кратного. Значительное повышение результативности осемене- ния получают от применения двукратного осеменения и увели- чения числа спермиев в дозе.
Влияние режима использования хряков на результаты осеменения. В процессе разработки метода замораживания спермы хряка было выяснено, что половые клетки этого вида удовлетворительно переносят глубокое охлаждение лишь при условии, если интервал между взятием спермы не менее 6–7 сут.
В.Я. Черных, Н.Я. Сорокина, В.П. Кононов и др. (1981) изу- чили содержание отдельных витаминов в крови и сперме хряков при действии частых эякуляций на организм животного. Сперму хряков брали с помощью искусственной вагины: в предопыт- ный период – 1 раз в неделю, в опытной – первые 10 эякулятов ежедневно, 11-й эякулят – через 20 сут. Оценивали сперму по общепринятым биологическим показателям.
Далее проводили исследования хранившихся в жидком азо- те цельной спермы и плазмы, полученной путем центрифугиро- вания цельной спермы. Глубокому охлаждению подвергали сперму, разбавленную синтетической средой по технологии В.П. Кононова и др. (1981).
На 1-е, 10-е и 31-е сутки опыта в сперме и плазме крови жи- вотных определяли содержание витаминов (альфа-токоферола, ретинола и аскорбиновой кислоты). Было установлено, что в период напряженного полового использования хряков в плазме крови значительно снижалось содержание витамина А (Р>0,01), концентрация которого не восстанавливалась до исходного уровня даже на 20-е сутки полового покоя. Видимо, это обу- словлено тем, что при напряженных режимах взятия спермы от хряков ухудшается усвояемость различных безазотистых соеди- нений. Однако потребность в витамине А остается высокой, так как витамин необходим для многих важных функций, активизи- руемых повышенной половой активностью.
Эти данные дают основание считать, что напряженная по- ловая функция хряков приводит к дефициту в организме вита- мина А, который не устраняется даже в течение 20-суточного полового покоя. Во всех случаях содержание витамина А в сперме обнаружить не удалось.
Режим взятия спермы существенно не влияет на концентра- цию в плазме крови хряков витамина Е. За период ежедневных взятий у хряков эякулятов концентрация токоферола в крови снижалась незначительно и вновь повышалась в течение перио- да полового покоя.
По мере увеличения длительности ежедневных взятий кон- центрация витамина Е в сперме увеличивалась. Так, на 8-е су- тки взятия спермы количество токоферола в эякуляте достовер- но отличалось от его содержания в сперме, взятой в 1-е сутки, затем снижалось на 10-е сутки до исходного уровня. После 20- суточного полового покоя содержание витамина Е в эякуляте хряков находилось на уровне исходных показателей, получен- ных в 1-е и на 10-е сутки взятия спермы. Таким образом, в пе- риод напряженного полового режима в сперме возросло количе- ство токоферолов.
Содержание аскорбиновой кислоты в сперме с увеличением периода взятия ежедневных эякулятов у хряков снижалось, из- меняясь на достоверную величину уже на 2-е сутки взятия, но за период полового покоя возрастало и превосходило исходный уровень.
Известно, что концентрация витамина С в сперме обуслов- лена активностью функции гипофиза, в частности продукцией лютеинизирующего гормона (ЛГ). Снижение ее содержания на- водит на мысль о возможности существенного изменения гор- монального статуса в организме животных под влиянием на- пряженных дней получения от хряков эякулятов. Видимо, час- тое взятие спермы повышает секрецию андрогенов, а высокая концентрация последних по принципу обратной связи подавля- ет выход ЛГ из гипофиза.
В связи с режимом использования хряков изменялись био- логические показатели спермы. С увеличением периода еже- дневных взятий у хряков эякулятов снижались в них концен- трация и общее число спермиев. Это происходило вследствие истощения эпидидимальных запасов половых клеток. Такие по- казатели, как объем эякулята и подвижность свежевзятой спер- мы, за этот период почти не изменялись, что согласуется с лите- ратурными данными. Интенсивное использование производите- лей не угнетает функции придаточных желез и почти не влияет
на соотношение подвижных и неподвижных половых клеток в сперме.
С увеличением периода интенсивного использования хря- ков-производителей резко уменьшался абсолютный показатель выживаемости спермы вне организма и утрачивалась устойчи- вость половых клеток к глубокому охлаждению. После полово- го отдыха эти показатели не только восстанавливались, но и превосходили исходные. Итак, при традиционных нормах корм- ления напряженный режим взятия спермы от хряков- производите-лей ведет к дефициту витамина А в организме. С целью устранения этого факта при интенсивном использовании хряков-производителей в их рационе необходимо увеличивать содержание витамина А или каротина либо повышать их усвоя- емость.
Для нахождения связи между биологическими характери- стиками спермы и ее оплодотворяемостью после глубокого ох- лаждения необходимы надежные критерии по совершенствова- нию метода. Первые исследования по его разработке показали, что существующие тесты оценки подвижности и живучести не- надежны для определения биологической полноценности спер- миев, подвергнутых замораживанию и оттаиванию. Делались попытки определения подвижности после 3-часовой выдержки при температуре 37–39°С с добавлением кофеина, то есть тер- морезисторный тест, или обработка спермы урбаином (стро- фантином), ингибирующим сопряженный транспорт через мем- браны Na и К.
Значительно надежнее отражают полноценность спермиев более сложные тесты, определяющие морфологический кон- троль акросомы фазово-контрастной микроскопией, или сте- пень повреждения мембран по ферментам.
Выяснено, что наиболее надежно прогнозировать эффек- тивность осеменения маток оттаянной спермой, возможно, на сумме показателей, отражающих состояние акросомы, энерге- тического и двигательного аппаратов. Чтобы получить 50 % опоросов от осеменения животных оттаянной спермой, под- вижность половых клеток должна быть не менее 0,35, сохран- ность при 37°С – не менее 4,5 ч, стимуляция дыхания – не ме- нее 1,6, сохранность акрозина и гиалуронидазы – не ниже 70 %.
Многие исследователи в качестве теста степени поврежде- ния спермиев в процессе замораживания используют изменение проницаемости мембран, о чем судят по утечке в плазму неко- торых ферментов и других органических и неорганических компонентов спермиев.
Широкое распространение получил тест утечки из спермиев глютамат-оксалат или аспарагиновой трансаминазы ACT. Тест этот основан на простом явлении: в спермиях полноценной свежевзятой спермы содержится основное количество транса- миназы и очень мало ее содержится в плазме. При воздействии на спермии факторами, повышающими проницаемость мембран или разрушающими их, ACT выделяется из спермиев и актив- ность ее в плазме резко повышается. Надежность этого теста не вызывала сомнений до тех пор, пока не появились данные о вы- сокой положительной корреляции плазмы спермы с оплодотво- ряемостью.
В.П. Кононов, Н.А. Голышев и др. (1978) изучали влияние отдельных факторов и этапов обработки спермы при охлажде- нии на выход трансаминаз из спермиев как показатель их опло- дотворяющей способности. Установлено, что выдержка нераз- бавленной спермы в аэробных условиях в пределах 6 ч не влия- ла на активность ACT в плазме спермы, содержание АЛТ сни- жалось по мере нахождения спермы вне организма. Выдержка разбавленной спермы в течение 5 ч в атмосфере водорода при- мерно в 3 раза повышала активность ACT в плазме, сохраняя на одном уровне активность АЛТ. Видимо, сама по себе выдержка спермы в течение 5 ч вне организма при 18–20°С не сказывается на состоянии мембран спермиев, в то время как разбавление спермы и анаэробные условия усиливают их проницаемость. Процессы замораживания и оттаивания в 5 раз по отношению к исходному увеличивали активность ACT в плазме, не влияя при этом на активность АЛТ.
Следовательно, разрушающее действие замораживания и оттаивания спермы может быть установлено только при утечке ACT из спермиев, но не при утечке АЛТ. Повышение прони- цаемости мембран и утечку ACT из спермиев, по-видимому, нельзя рассматривать только как отрицательное явление. Обра- ботка путем анаэробной выдержки и разбавление спермы зна- чительно повышают устойчивость половых клеток при охлаж- дении, но отмечается сильная утечка от них ACT, тогда как при
аэробной выдержке неразбавленной спермы подвижность поло- вых клеток почти прекращается и они погибают еще до охлаж- дения, но утечки ACT не происходит. Наилучшая подвижность половых клеток после оттаивания наблюдалась в средах, содер- жащих смесь двух или трех сахаров. Первый оптимум был представлен смесью глюкозы (42 % изотонического раствора) и сахарозы (28 %), второй – при сочетании трех сахаров: глюкозы (14 %), фруктозы (14 %) и сахарозы (42 %). Однако минималь- ное выделение фермента (что соответствует меньшему повреж- дению спермиев) отмечалось в средах, неэлектролитная часть которых была представлена одной глюкозой (70 % изотониче- ского раствора) или смесью трех сахаров, точно соответствую- щей одному из оптимальных соотношений, найденных по под- вижности после оттаивания: 14% глюкозы и фруктозы, 42 % са- харозы.
Наилучшие результаты при использовании замороженной спермы были получены после разбавления средой, содержащей в качестве неэлектролитной части смесь всех трех сахаров (86
% опоросов против 58 % в контроле).
Выделение аспарагиновой трансаминазы из половых клеток при замораживании спермы хряка хотя и отражает степень био- логической их полноценности, но не всегда связано с отрица- тельными последствиями того или иного воздействия, так как усиление проницаемости мембран половых клеток для ACT в процессе подготовки спермы сопровождается повышением их устойчивости к воздействию замораживания. Возможно, что это сопутствующее явление и положительное действие анаэробной выдержки разбавленной спермы на половые клетки обусловле- но не простым нарушением целостности мембран, а другими структурными или функциональными превращениями. Степе- нью снижения содержания в спермиях ACT не всегда можно оценить степень их повреждений. Вероятно, приходится иметь дело с двумя видами изменения мембран: первый — изменение функции морфологически неповрежденных мембран; второй — нарушение их целостности (V. G. Pursel et al., 1972). Такая двоя- кая обусловленность утечки ACT из половых клеток исключает возможность использования этого теста как достаточно надеж- ного для оценки их биологической полноценности при даль- нейшем совершенствовании метода замораживания спермы.
Однако если сравнить его с оценкой спермы по подвижности половых клеток после оттаивания, то наши результаты свиде- тельствуют о преимуществе теста степени их повреждений (утечки ACT из половых клеток).
Основные методы замораживания спермы хряков (отече- ственные методы криоконсервировании спермы хряков). Техно- логия метода замораживания спермы хряков ВИЖ представлена двумя вариантами: 1) замораживание всего эякулята без концен- трирования; 2) использование концентрирования спермиев.
Замораживание спермы по этой технологии проводили сле- дующим образом. После взятия эякулята сперму в течение 1 ч выдерживали при температуре 18–20°С. Затем разбавляли (1:1) средой, состоящей из 50 г сахарозы, 8 г – глюкозы, 8 г – фрукто- зы, 4 г – ЭДТА, 3 г – цитрата натрия трехзамещенного, пятивод- ного, 2 г – аммония сернокислого, 0,6 г – трис-(оксиметил)- аминометана, 1 л воды, 40 мл глицерина, 50 мл желтка свежего куриного яйца.
С целью создания анаэробиоза емкость с разбавленной спермой насыщали газообразным водородом. Если сперму за- мораживали для осеменения маток, то ее разливали в пробирки с пробками, снабженными краниками. С помощью вакуумного насоса из сосуда со спермой откачивали воздух, а образующий- ся вакуум заполняли водородом. Сперму, насыщенную водоро- дом, выдерживали при температуре плюс 15°С в холодильнике, оснащенном терморегулирующим устройством в течение 4–5 ч. После выдержки в холодильнике разбавленную сперму быстро охлаждали до температуры 0–5°С, помещая сосуды со спермой в тающий лед.
Для разлива спермы на поверхности сухого льда или охлаж- денной фторопластовой пластины нами совместно с В.П. Коно- новым (1983) были предложены аппараты П. Боброва, А.А. Шилова, шприц-полуавтомат и другие устройства.
Сперму оттаивают с соблюдением принципа немедленного отделения образующейся жидкой фазы от твердой с помощью специальных устройств (В.П. Кононов и др. 1975), которые в 1981–1982 гг. были усовершенствованы.
Свиноматок, пришедших в охоту, выбирают по рефлексу неподвижности и осеменяют двукратно с интервалом 10–12 ч. Первое введение спермы (дозой 100 мл с содержанием не менее 3 млрд спермиев подвижностью не ниже 3 баллов) проводят че-
рез 12 ч, а повторное – через 24 ч после выявления рефлекса неподвижности.
Применяя такую технологию, в колхозе им. Фрунзе Белго- родской области оттаянной спермой было осеменено 153 сви- номатки, из которых опоросилось 94 (61±4 %) со средней вели- чиной гнезда 9,4 жизнеспособного поросенка. В благоприятный период года (январь-февраль) от 90 осемененных маток было получено 67 опоросов 74±5 %.
В.П. Кононовым, А.Г. Нарижным и др. (1981) была разрабо- тана новая технология замораживания спермы в концентриро- ванном состоянии. Эякулят хряка сразу после взятия разбавили при соотношении 1:1 средой, разработанной В.К. Миловановым (1962), следующего состава: воды – 1 л, глюкозы – 50 г, цитрата натрия 5,5-водного – 4,8 г, кислоты лимонной – 0,18 г. Разбавле- ние проводят при температуре среды плюс 30°С. В течение 2 ч сперму охлаждают до плюс 15°С, после чего половые клетки осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин. Насадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендиру- ют в среде для замораживания следующего состава: воды – 100 мл, лактозы 1-водной – 11,5 г, глицерина – 3 мл, желтка – 20 мл. Ресуспендированные половые клетки в течение 2 ч охла- ждают до плюс 5°С, после чего замораживают гранулами на су- хом льду на фторопластовой пластине, предварительно охлаж- денной до температуры минус 100°С. Оттаивают сперму по раз- работанному ранее принципу: с максимально быстрым подводом тепла и с немедленным отделением образующейся жидкой фазы от твердой или с помощью модифицированного устройства. От- таянную сперму разбавляют в соотношении 1:4 средой следую- щего состава: воды – 1 л, глюкозы – 30 г, натрия лимонно- кислого – 4 г, ЭДТА – 1 г, натрия пировинограднокислого – 10 г.
При этом методе замораживания испытывали и эффектив- ность введения БОТ в среду второго разбавления (лактозно- глицерин-желточную), изучали и эффективность гормональной обработки свиноматок при осеменении окситоцином и эстра- диолом+окситоцином. Свиноматок с рефлексом неподвижности делили на 3 группы. Входящих в I группу осеменяли без гормо- нальных обработок. Перед осеменением животных II группы в сперму добавляли 5 ед. окситоцина. При осеменении свинома- ток III группы в сперму также добавляли окситоцин, но за 1 ч до осеменения животных внутримышечно им вводили 1 мг
масляного раствора эстрадиола пропионата. Окситоцин добав- ляли в сперму с целью усиления моторики матки в период осе- менения животных так, чтобы сперма как можно быстрее попа- ла к верхушкам рогов матки, где имеются наилучшие условия для выживаемости спермиев.
Предварительно вводя эстрадиол, мы как бы профилактиру- ем отрицательное воздействие окситоцина в тех случаях, когда по какой-либо причине в крови животных был недостаточно высокий уровень эстрогенов и сокращения от окситоцина могли быть ориентированы в нежелательную сторону. Кроме того, эс- трогены значительно повышают чувствительность миометрия к окситоцину, чем усиливается его воздействие.
Анализ результатов осеменения в связи с разными методами замораживания спермы (традиционного в неконцентрирован- ном состоянии или по-новому – в концентрированном), а также в связи с применением антиокисляющих факторов показал, что БОТ, будучи введенным в среду, статистически высокодосто- верно повышает результаты осеменения оттаянной неконцен- трированной спермой, но не влияет на результаты осеменения оттаянной спермой в концентрированном состоянии. Очевидно, это объясняется тем, что при замораживании неконцентриро- ванной спермы применяется среда, содержащая всего лишь 5 % желтка куриного яйца. Более того, содержание компонентов желтка в сперме во много раз снижается преципитацией с бел- ковыми компонентами плазмы. Этим уменьшается защитное действие среды против холодового удара. Как было выяснено в последнее время, соединения типа БОТ способны растворяться в липидном слое мембран и аналогично действию лецитина желтка разжижать эти липиды, отодвигая точку их кристалли- зации и затвердевания в зону низких температур. Это является основным средством смягчения холодового удара. При замора- живании концентрированной спермы в среде содержится в 4 раза больше желтка, кроме того, липопротеины желтка не при- ци-питируют с компонентами плазмы, поскольку последняя удаляется при центрифугировании. В связи с этим защитное действие лецитина желтка значительно.
Результаты осеменения концентрированной спермой были значительно ниже, чем неконцентрированной. Видимо, это вы- звано отсутствием в сперме нативной плазмы, которая оказыва- ет положительное действие как на сами спермии, так и на орга-
низм самки. Второй аспект положительного действия плазмы пока еще недостаточно изучен. Известно лишь, что плазма мо- жет ускорять наступление овуляции, причем действие это свя- зано не с механическим влиянием на матку, а с сугубо специфи- чески биологическим: введение в том же объеме физраствора или сред этого эффекта не дает.
Гормональная обработка свиноматок, особенно в сочетании эстрадиола с окситоцином, показала явную тенденцию к повы- шению результативности осеменения, хотя статистически дос- товерного различия не обнаружено. Видимо, положительный эффект от стимуляции моторики матки есть, но незначитель- ный.
До настоящего времени криопротективные факторы (глице- рин, сахара и другие компоненты) вводили в сперму перед ее замораживанием путем разбавления минимум в 2 раза. Такой способ повышает устойчивость спермиев при охлаждении. В более ранних исследованиях было выяснено, что инкубация спермиев хряков в присутствии естественной плазмы спермы ведет к адсорбции на их поверхности катионных белков из сек- рета пузырьковидных желез, повышающих гетерогенность ли- пидного слоя плазматических мембран. При замораживании это приводит к щадящему аморфному затвердеванию мембранных липидов. Разбавление спермы снижает концентрацию белков, что препятствует адсорбционному насыщению плазматических мембран спермиев этими факторами. Обработка спермы диали- зом устраняет этот недостаток разбавления – концентрация бел- ков в плазме не снижается, соответственно происходит более глубокая перестройка структуры мембран и этим достигается более высокая устойчивость их при замораживании.
Исследования по оптимизации отдельных условий обработ- ки спермы диализом привели к следующей технологии. Среди множества испытанных диализационных пленок наиболее эф- фективной для обмена компонентами жидкой части спермы и среды оказалась гидратцеллюлозная мембрана. Испытание от- дельных сред показало, что для ведения диализа спермы больше всего подходит среда следующего состава: на 1 л дистиллиро- ванной воды – 42 г глюкозы, 4 г ЭДТА двуводной соли, 3 г на- трия цитрат, 2 г аммония сульфата, 0,6 г трис- (гидроксиметил)- аминометана, 40 мл глицерина. Для диализа применяли простое
приспособление. От стеклянной бутылки диаметром 20 см было отрезано дно и вместо него натянута диализационная пленка, закрепленная резиновыми кольцами. Чтобы пленка хорошо на- тянулась перед тем как закреплять на сосуде, ее размачивали в дистиллированной воде и после натяжения просушивали. Плен- ка выдерживает нагрев до 100°С, поэтому все устройство мож- но стерилизовать при такой температуре.
Весь эякулят сразу после взятия помещали в сосуд непо- средственно на пленку. Удовлетворительная обработка спермы получается лишь в том случае, если толщина ее слоя не превы- шает 10 мм. Дно сосуда погружали в среду на глубину 2–3 мм (необходимо, чтобы объем среды был в 2 раза больше объема спермы). Диализ спермы проводят в течение 5–6 ч при 15°С. Для обеспечения такой температуры можно воспользоваться бытовым компрессорным холодильником, снабженным допол- нительным биметаллическим регулятором, помещенным в шкаф и включенным в электрическую цепь питания компрессо- ра холодильника. Затем к сперме добавляют смесь желтка и 2,9
%-ного раствора цитрата натрия (1:1) – 10 % от объема спермы и продолжают диализировать, переключив регулятор холодиль- ника на 4°С. Через 2 ч сперма принимает эту температуру.
Чтобы повысить эффективность обмена низкомолекуляр- ными соединениями плазмы спермы и среды, был разработан и второй вариант обработки путем диализа. Для этого было скон- струировано специальное устройство. Миниатюрный электро- двигатель с редуктором закрепляли на штанге, фиксируемой с помощью винтового зажима на стойке лабораторного штатива. На выходном валу редуктора имеется приспособление для фик- сации диализационного сосуда. Редуктор и двигатель подбира- ются так, чтобы обеспечивалось медленное (1 оборот в минуту) вращение диализационного сосуда. Штангу, на которой крепит- ся двигатель с редуктором, можно закреплять на любой высоте стойки штатива и поворачивать, а также закреплять, придавая плоскости мембраны положение под углом к горизонту.
Устройство работает следующим образом. После внесения спермы в диализационный сосуд дно его погружают в диали- зующую среду, подставив снизу другой сосуд со спермой, и, выбрав надлежащее положение для штанги по высоте, фикси- руют его в этом положении. Затем, поворачивая штангу по ее
продольной оси, придают ей такое положение, чтобы диализа- ционная пленка находилась под углом 10–15° к горизонту (по- верхности среды). Положение штанги по высоте надо подкор- ректировать так, чтобы при этом вся площадь пленки была по- гружена в диализующую среду. Во время диализа включают пи- тание двигателя и диализационный сосуд начинает медленно вращаться. При этом сперма постепенно переливается по плен- ке, а другая сторона пленки постоянно обмывается новыми порциями среды. Такой способ диализа позволяет в несколько раз ускорять обмен низкомолекулярными компонентами между средой и спермой и повышать эффективность обработки. Диа- лиз также проводят в течение 5–6 ч при температуре 15°С и по- сле добавки желточно-цитратной смеси – в течение 2 ч при температуре 4°С. После криопротективной обработки сперму замораживают так же, как при обычной, ранее разработанной технологии, то есть гранулами на сухом льду или на охлажден- ной фторопластовой пластине.
Замороженную сперму переносят в жидкий азот на хране- ние. Оттаивают ее непосредственно перед осеменением «су- хим» методом с немедленным подводом теплоносителя (воды) и с быстрым отделением жидкой фазы от твердой по мере ее об- разования. При этом температура теплоносителя не должна превышать физиологических пределов (42°С), а высокая ско- рость подвода тепла достигается путем быстрого движения во- ды из ультратермостата в специальное устройство для оттаива- ния.
Поскольку используется неразбавленная сперма, то доза ее для осеменения составляет 50 мл. Осеменяли свиноматок фрак- ционно (по А. В. Квасницкому) с помощью прибора УПОС. При этом в их половые пути вводили 50 мл оттаянной и медленно нагретой спермы до температуры 38°С, следом вводили 50 мл изотонического 2,9 %-ного раствора лимонно-кислого натрия, также нагретого до 38°С. Подвижность оттаянной спермы со- ставляла 40–50 %. Живучесть при температуре 39°С – около 5 ч.
После осеменения 28 маток спермой, обработанной перед замораживанием диализом по первому способу (без перемеши- вания), опоросилось 15 маток (53±9 %) и родилось 139 поросят (9,2 поросенка на опорос). При осеменении спермой, подвергну- той диализу вторым способом (с перемешиванием), из 68 маток
опоросилось 42 (62±6) и родилось 416 поросят (9,9 поросенка на опорос). Практическое использование метода выявило необхо- димость разработки более совершенного технологического ос- нащения его, что и было сделано в первоначальном варианте.
В порядке решения этой задачи были проведены соответст- вующие модернизации, которые коснулись прежде всего уст- ройства для диализной обработки спермы. Вместо диализаци- онного сосуда была сконструирована диализационная камера.
В качестве диализующих была использована разработанная в 1975 г. В. П. Кононовым среда следующего состава: лактоза
— 84 г, глюкоза – 6 г, ЭДТА – 4 г, триаммоний цитрат – 2 г, трис- (оксиметил)-аминометан – 0,6 г, глицерин – 40 мл, воды дистил- лированной – 1 л.
После заполнения камеры сперму выдерживают в ней при температуре плюс 15°С в течение 4–5 ч. После этого среду сли- вают, а сперму переливают в стеклянный сосуд (стаканчик или колбу) и к нему добавляют смесь желтка куриного яйца и изо- тонического раствора цитрата натрия (1:1) в количестве 5 % от объема спермы. После тщательного перемешивания ее охлаж- дают при 15°С в течение 1 ч и замораживают гранулированием на охлажденных фторопластовых пластинах.
Для замораживания спермы было использовано специаль- ное устройство Н.П. Ющенко и др., которое нами было не- сколько модернизировано. При этом замороженную сперму со- бирают в мешочки, которые переносят в сосуды Дьюара с жид- ким азотом на сохранение. Перед использованием сперму от- таивают, затем в разных пропорциях разбавляют изотоническим раствором цитрата натрия и используют для осеменения маток.
Лабораторные испытания способа криопротективной обра- ботки спермы показали, что в сравнении с традиционным раз- бавлением диализ обусловливает лучшую сохранность акросом при замораживании, а затем оттаивании, существенно не влияя на подвижность и живучесть половых клеток при 38°С.
В производственных опытах новый способ был испытан на оплодотворяемость. Сперму (густую фракцию эякулята) в замо- роженном состоянии заготавливали от хряков крупной белой породы на СЦИО (Московская обл.) и в племсовхозе «Гибрид- ный» ЭПО «Поволжское» (Куйбышевская обл.). Свиноматок осеменяли в совхозе «Московский» Камчатской области и в
совхозе «Ленинское знамя» Сахалинской области. Свиноматок осеменяли двукратно. Независимо от вариантов обработки на каждое осеменение брали по 50 мл оттаянной спермы и добав- ляли к 50 мл изотонического (2,9 %) раствора цитрата натрия.
В задачу входило: сравнить результаты осеменения оттаян- ной спермой с применением традиционного способа разбавле- ния и обработки диализом (табл. 181).
Таблица 181
Дата добавления: 2019-07-17; просмотров: 181; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!