Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы.// Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
Принцип метода
Метод основан на способности перекиси водорода образовывать стойкий окрашенный комплекс с солями молибдена. Каталаза, присутствующая в биологическом субстрате, разрушает перекись водорода, а неразложившаяся перекись связывается с молибдатом аммония. Чем активнее каталаза, тем меньше в биологическом материале остается Н2О2 и, соответственно, тем менее интенсивно окрашены экспериментальные растворы по сравнению с контролем
Н2О2 —каталаза→ 2Н2О + О2↑
Н2О2 —пероксидаза→ 2Н2О + О=R=O
Инкубировать ≈5 минут при комнатной температуре для развития окраски
СФ при λ = 410 нм
Кювета с длиной оптического пути 1 см
Против дистиллированной воды
Расчет
Активность каталазы выражают в нмоль Н2О2/мг Hb. Расчет ведут по формуле:
, где
Екон – оптическая плотность контрольного раствора (безразмерная)
Еоп – оптическая плотность опытного раствора (безразмерная)
Vпробы – объем всей пробы (л)
ε0 – коэффициент миллимолярной экстинкции комплекса перекиси водорода с молибдатом аммония. 2,22 (мМ-1*см-1)
l – длина оптического пути (см)
Vbios – объем вносимого биосубстрата (л)
Сhb – концентрация гемоглобина (г/л)
Приготовление реактивов
1) 0,03% перекись водорода
H2O2 Mr = 34
1 мл 3% аптечной перекиси водорода доводится дистиллированной водой до метки в колбе на 100 мл. Концентрированная H2O2 дает высокую интенсивность окраски. Для определения концентрации перекиси водорода её можно титровать перманганатом калия.
2) 4% молибдат аммония
Син: парамолибдат аммония; (NH4)6Mo7O24*4H2O Mr = 1235,69
4 г молибдата аммония растворить в дистиллированной воде в колбе на 100 мл
Примечания
Оптическая плотность контроля должна быть больше оптической плотности опыта. Активность каталазы может быть очень высокой, тогда следует сократить время инкубации или объем вносимого биоматериала. Если при вышеописанной схеме опыта оптическая плотность опыта составляет 0,12-0,13 единиц – это свидетельствует, что оптическую плотность дает только внесенный гемоглобин, а комплекс перекиси с молибдатом скорее всего отсутствует. Следовательно, каталаза разложила перекись водорода до окончания срока инкубации, и её активность определена неверно.
Определение общего белка методом Lowry
Источник
Lowry O.H. et. al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – v. 193. – P. 265-275
Принцип метода
В основе метода лежит реакция с реагентом Фолина-Чокалтеу, активным компонентом которого является комплекс «молибдат-вольфрамат-фосфорная кислота». Возникающее окрашивание объясняется одновременным протеканием биуретовой реакции на пептидные связи и процесса восстановления реактива Фолина циклическими аминокислотами, входящими в состав белковых молекул.
Чувствительность метода: 0,01 – 0,1 мг / мл (10 – 100 мкг/мл).
Биоматериал
Суспензии и гомогенаты клеток; гомогенаты тканей; плазма или сыворотка крови, разведенные в 100 раз физраствором.
Реактивы
Реактив А
Реактив В
Реактив С
Физиологический раствор
Рабочий реактив Фолина
Оборудование
Обычные химические пробирки, штатив, дозатор, СФ
Ход работы
опыт
контроль
100 мкл биоматериала
+2 мл реактива С
100 мкл физ.раствора
+2 мл реактива С
Инкубация в темноте 10 минут при комнатной температуре
Инкубация в темноте 10 минут при комнатной температуре
+4 мл раб. реактива Фолина
+4 мл раб. реактива Фолина
Инкубация 30 минут в темноте при комнатной температуре
, где
Екон – оптическая плотность контрольного раствора (безразмерная)
Еоп – оптическая плотность опытного раствора (безразмерная)
Vпробы – объем всей пробы (л)
ε0 – коэффициент миллимолярной экстинкции комплекса перекиси водорода с молибдатом аммония. 2,22 (мМ-1*см-1)
l – длина оптического пути (см)
Vbios – объем вносимого биосубстрата (л)
Сhb – концентрация гемоглобина (г/л)
