Инкапсулирование эремомицина в мышиные и человеческие эритроциты, оценка эффективности.

7.1 Исследование проницаемости мембраны эритроцитов человека для эремомицина при инкубации их с раствором эремомицина.

Эритроциты выделяли из консервированной донорской крови, заготовленной с гемоконсервантом "Глюгицир". Кровь центрифугировали 10 минут при 1000 g и удаляли надосадок. Затем эритроциты отмывали два раза в изотоническом забуференном растворе ( раствор PBS ) следующего состава: NaCl - 140mM, Na₂HPO₄ - 9mM, NaH₂PO₄ - 1,3mM, глюкоза - 1mM, pH=7,4. В полученной суспензии определяли гематокрит. К выделенным эритроцитам добавляли эремомицин до концентрации 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,5 мг/мл и инкубировали при температуре 37^оС в течение 90 минут. В течение инкубации отбирались пробы для определения концентрации эремомицина во всей суспензии и в инкубационной среде. Концентрация эремомицина определялась спектрофотометрически на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по измерению высоты пика оптической плотности в спектре эремомицина при длине волны 280 нм. В качестве калибровочных растворов использовались водные растворы эремомицина известной концентрации.

7 .2 Определение повреждающего воздействия эремомицина на эритроциты человека

Повреждающее воздействие эремомицина на эритроциты человека определяли по выходу гемоглобина из эритроцитов. Использовались консервированные донорские эритроциты. Перед экспериментом трехкратно отмывалось 10 мл эритроцитов в трехкратном объеме изотонического буферного раствора PBS центрифугированием 10 минут при 1000 g. К отмытым эритроцитам добавляли раствор эремомицина в PBS до концентрации 6 мг/мл суспензии и инкубировали 2 часа при температуре 37^оС. Концентрацию гемоглобина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре гемоглобина при длине волны 415 нм. Общее содержание гемоглобина в суспензии определяли по высоте пика при 415 нм в спектре водного лизата суспензии. Относительный выход гемоглобина (в %) определяли как отношение высот пиков при 415 нм в спектрах надосадочного раствора и водного лизата. В качестве контроля использовались эритроциты того же донора, инкубированные при тех же условиях без эремомицина.

7.3 Включение эремомицина в эритроциты человека

Эремомицин вводили в эритроциты методом обратимого осмотического лизиса. Эритроциты выделяли из консервированной донорской крови путем трехкратной отмывки 10 мл эритроцитов в трехкратном объеме изотонического буферного раствора PBS центрифугированием 10 минут при 1000 g. Затем эритроциты отмывали один раз инкубационным раствором следующего состава: 133 мМ NaCl, 3mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM Na₂HPO₄, 50 mM трис-HCl, pH=7.5. В качестве лизирующего раствора использовался раствор, содержащий 5 мМ глюкозы, 2 мМ MgCl₂ и эремомицин в растворе PBS в концентрации 0,3 мг/мл, 1 мг/мл, 1,9 мг/мл, 3,0 мг/мл, 6,0 мг/мл, 10,0 мг/мл суспензии. Отмытые эритроциты смешивали с 4-кратным объемом лизирующего раствора и выдерживали 1 мин при 4^оС. К полученной суспензии добавляли эквивалентный объем запечатывающего раствора, содержащего 20mM Na₂HPO₄, 310mM NaCl, 1mM MgCl₂, 5mM глюкозы. Смесь инкубировали 30 мин при 37^оС. После этого заполненные эритроциты осаждали центрифугированием 10 минут при 1000 g, надосадочный раствор удаляли, а эритроцитарную массу трижды отмывали трехкратным объемом инкубационного раствора. Общий объем эритроцитов определяли по гематокриту суспензии.

Для контроля количества запечатанного в эритроциты препарата концентрацию эремомицина определяли спектрофотометрически в перхлорных экстрактах. Для этого пробу суспензии смешивали с 2-кратным объемом 0,5 М раствора перхлорной кислоты и осаждали белки центрифугированием 10 минут при 1000 g. Концентрацию эремомицина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре эремомицина при длине волны 280 нм. В качестве калибровочных растворов использовались водные растворы эремомицина известной концентрации. В качестве контроля использовались перхлорные экстракты суспензии эритроцитов того же донора, прошедших те же стадии лизиса, запечатки и инкубации, но без эремомицина.

7.4 Включение эремомицина в эритроциты мышей

Эремомицин вводили в эритроциты мышей методом обратимого осмотического лизиса. Эритроциты выделяли из свежевзятой мышиной крови путем трехкратной отмывки в изотоническом забуференном растворе PBS центрифугированием 10 минут при 1000 g. Затем эритроциты отмывали один раз инкубационным раствором следующего состава: 133 мМ NaCl, 3mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM Na₂HPO₄, 50 mM трис-HCl, pH=7.5. В качестве лизирующего раствора использовался раствор, содержащий 5 мМ глюкозу, 2 мМ MgCl₂ и эремомицин в растворе PBS до концентрации 0,2 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл суспензии. Отмытые эритроциты смешивали с 4-кратным объемом лизирующего раствора и выдерживали 1 мин при 4^оС. К полученной суспензии добавляли эквивалентный объем запечатывающего раствора, содержащего 20mM Na₂HPO₄, 310mM NaCl, 1mM MgCl₂, 5mM глюкозы. Смесь инкубировали 30 мин при 37^оС. После этого заполненные эритроциты осаждали центрифугированием 10 минут при 1000 g, надосадочный раствор удаляли, а эритроцитарную массу трижды отмывали трехкратным объемом инкубационного раствора. Общий объем эритроцитов определяли по гематокриту суспензии. Для контроля количества запечатанного в мышиные эритроциты препарата концентрацию эремомицина определяли спектрофотометрически в перхлорных экстрактах, как описано выше.

7.5 Определение противобактериальной активности эремомицина, включенного в эритроциты человека.

В данном опыте использовался штамм Stafilococcus aureus (золотистый стафилококк), резистентный к ампициллину. Бактериальная нагрузка - 10⁷ бактериальных тел в мл. В чашки Петри с бактериальным газоном по секторам наносили исследуемые растворы и суспензии.

Для определения противобактериальной активности эремомицина, включенного в эритроциты, в чашках Петри с бактериальным газоном ставились следующие пробы:

1. Эремомицин, включенный в эритроциты и разведенный инкубационным раствором до следующих концентраций антибиотика: 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0.5 мг/мл.

2. Гемолизат эритроцитов с включенным эремомицином, разведенный дистиллированной водой до следующих концентраций 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл.

В качестве контролей к эритроцитарной форме эремомицина использовались:

1. Раствор для инкубации эритроцитов.

2. Лизирующий раствор, использовавшийся для приготовления эритроцитов, нагруженных эремомицином.

3. Раствор для запечатывания эритроцитов.

4. Дистиллированая вода.

5. Эритроциты без антибиотика, прошедшие те же стадии лизиса, запечатки и инкубации, но без эремомицина.

6. Раствор чистого антибиотика в соответствующих концентрациях.

Пробы инкубировали 18 часов при температуре 37^оС.

7.6 Определение минимально подавляющей концентрации антибиотика, включенного в эритроциты человека.

В чашку Петри с бактериальным газоном, разделенным по секторам, наносили гемолизат эритроцитов с включенным эремомицином, разведенный дистиллированной водой до следующих концентраций антибиотика: 2000мкг/мл, 1000мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 62,5 мкг/мл, 31,25 мкг/мл, 15,6 мкг/мл, 7,8 мкг/мл.

В качестве контроля использовалась суспензия эритроцитов без антибиотика и антибиотик, разведенный дистиллированной водой в соответствующих концентрациях. Пробы инкубировали 18 часов при температуре 37^оС.

7. 7 Исследование действия эремомицина, включенного в мышиные эритроциты на мышей, зараженных золотистым стафилококком.

Для эксперимента использовался штамм Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк). Пятнадцать мышей заражали внутрибрюшинно золотистым стафилококком из рассчета летальной дозы, равной 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на одну мышь. Пять мышей заражали дозой 125 млн. бактериальных тел в 0,5 мл. на одну мышь.

В качестве контроля использовали раствор эремомицина в концентрации 200 мкг\мл, который вводили подкожно пяти мышам, зараженным летальной дозой стафилококка, равной 250 млн. бактериальных тел на одну мышь.

Для лечения пяти мышам, зараженным летальной дозой подкожно вводили эритроциты, загруженные эремомицином, концентрация которого составляла 200 мкг\мл.

Оставшихся десять мышей, из которых пять были заражены дозой 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл. на одну мышь, и пять, зараженных дозой 125 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на мышь, лечению не подвергались.

7.8 Исследование действия эремомицина, включенного в эритроциты человека, на мышей, зараженных золотистым стафилококком.

Для исследования использовался штамм Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк). 26 мышей заразили внутрибрюшинно летальной дозой стафилококка, равной 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на одну мышь и 5 мышей дозой 125 млн. бактериальных тел на одну мышь.

Для лечения пяти мышам подкожно вводили эритроциты, загруженные эремомицином и разведенные раствором для инкубации до концентрации 400 мкг/мл, и пяти мышам вводили те же эритроциты, разведенные до концентрации 200 мкг/мл.

В качестве контроля использовался раствор эремомицина, который вводили в концентрациях 400 мкг/мл и 200 мкг/мл такому же количеству мышей. Одной незараженной мыши подкожно вводили суспензию эритроцитов без антибиотика для выяснения, оказывают ли человеческие эритроциты непосредственное патогенное влияние на мышей. Оставшихся десять мышей (пять, зараженных дозой 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на одну мышь, и пять, зараженных дозой 125 млн. бактериальных тел в 0,5 мл ) не лечили.

Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 160; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 34

Мы поможем в написании ваших работ!