Используемые лекарственные препараты и химические реактивы

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 4Следующая ⇒

В работе для клинических исследований использовался фармацевтический препарат рубомицина - рубомицина гидрохлорид (ФАО «Ферейн», Россия); фармацевтические препараты доксорубицина - доксорубицина гидрохлорид (ФАО «Ферейн», Россия), адриабластин («Farmitalia», Италия), адриабластин («Pharmacia&Upjohn», Италия), растоцин (АО «Плива», Хорватия); фармацевтический препарат винкристина – винкристина сульфат («Pierre fabre», Франция); липосомольная форма рубомицина – DaunoXome («NeXstar», США); фармацевтический прапарат эремомицина – эремомицина сульфат, любезно предоставленный Институтом по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Для отбора аутокрови у пациентов использовались стандартные пластиковые контейнеры «Гемакон» (Россия), содержащий 100 мл гемоконсерванта «Глюгицир» (натрия гидроцитрата двузамещенного - 20 г, глюкозы - 30 г, воды для инъекций – до 1 л), или пластиковые контейнеры фирмы Baxter, содержащий 63 мл гемоконсерванта CPDA-1 (декстрозы – 2 г, натрия гидроцитрата - 1,66 г, лимонной кислоты - 206 мг, натрия монофосфата – 140 мг, аденина – 17,3 мг).

Для экспериментов in vitro использовались химические реактивы, производства «Реахим», чистота – «осч» или «чда»

Методики определения антрациклиновых антибиотиков в биологических жидкостях (кровь, плазма, костный мозг, ликвор, амниотическая жидкость).

Для определения рубомицина и доксорубицина в крови и плазме крови использовался спектрофлюориметрический метод, описанный в [Атауллаханов 1998, Куликова 1998 ]. Рубомицин и доксорубицин из образцов экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃ и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация рубомицина и доксорубицина определялась спектрофлюорометрически по излучению на длине волны 600 нм (для рубомицина) и 588 нм (для доксорубицина) при длине волны возбуждения 476 нм. Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации. В работе использовались спектрофлюориметры Jobin Yvon Spectrofluo JY3 D (Франция) и Shimadzu (Япония). Минимальная концентрация препарата, которую позволяет определить спектрофлюориметрический метод в пробах крови и плазмы, составляла 20 нг/мл для Jobin Yvon Spectrofluo JY3 D и 10 нг/мл для Shimadzu RF-5000.

Для разработки методики определения рубомицина и доксорубицина в костном мозге, ликворе и амниотической жидкости предварительно была исследована возможность хлороформной экстракции рубомицина и доксорубицина из образцов костного мозга, ликвора и амниотической жидкости. Для этого к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃, после этого – 3.0 мл, 5.0 мл или 10.0 мл хлороформа. Далее смесь интенсивно встряхивалась. Показано, что из образцов ликвора и амниотической жидкости полная экстракция осуществима при добавлении 3 мл хлороформа. Из образцов костного мозга полной экстракции добиться не удалось (только 70-80%).

Также была исследована возможность точного количественного определения рубомицина и доксорубицина, экстрагированного из образцов ликвора и амниотической жидкости. Для этого спекторфлюориметрически определенная (заранее известная) концентрация рубомицина и доксорубицина, экстрагированного из образцов, сравнивалась с калибровочной прямой, построенной с использованием хлороформных экстрактов растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации в воде. Установлено соответствие.

Из проделанной работы следует, что методика определения рубомицина и доксорубицина в образцах ликвора и амниотической жидкости не отличается от таковой для крови и плазмы.

Для определения рубомицина и доксорубицина в образцах костного мозга предлагается использовать ту же методику, что и для образцов крови и плазмы, только в качестве калибровки использовать хлороформные экстракты из калибровочных образцов костного мозга. Для этого несколько образцов костного мозга, не содержащего антрациклины, следует смешать с раствором рубомицина или доксорубицина (в зависимости от того, концентрацию какого антибиотика нужно определить в костном мозге) известной концентрации. Суспензии инкубировать при 37^оС в течение 0,5 – 1,0 часа при перемешивании. Таким образом приготовятся калибровочные образцы костного мозга, содержащие известную концентрацию антибиотика.

Отдельно установлено, что образцы костного мозга, ликвора и амниотической жидкости можно хранить в замороженном виде при температуре (–15^оС) – (- 20^оС) без потери спектрофлюориметрических характеристик рубомицина или доксорубицина не менее 3 месяцев.

3. Связывание рубомицина и доксорубицина с эритроцитами пациентов.

Было исследовано связывание рубомицина и доксорубицина с эритроцитами здоровых доноров и пациентов. Эти исследования проводились в цельной крови и в суспензии отмытых клеток. Для этого к цельной крови или суспензии эритроцитов добавлялся раствор рубомицина или доксорубицина, после чего смесь инкубировали при перемешивании в течение трех часов при 37^оС. Для отмывки и инкубации отмытых эритроцитов использовался изотонический буферный раствор PBS. Во время инкубации отбирались образцы для определения концентрации препарата в пробе и во внеклеточной среде (для отделения клеток образцы центрифугировались 10 минут при 1000 g). Концентрация рубомицина в эритроцитах рассчитывалась на основании данных о его концентрации в крови (в суспензии) и во внеклеточной среде по формуле:

Ce = (Co – Cm(1 – Ht))/Ht

где

Ce - концентрация антибиотика в эритроцитах,

Co – концентрация антибиотика в крови (в суспензии),

Cm - концентрация антибиотика в среде,

Ht – значение гематокрита крови (суспензии).

Рубомицин и доксорубицин из образцов экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃ и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация препарата в хлороформных экстрактах определялась спектрофотометрически по поглощению света на длине волны 486 нм для рубомицина и 500 нм для доксорубицина (точность измерения 5%). Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации.

Отдельно было проверено возможное связывание рубомицина с полимерным контейнером, а также изучена кинетика связывания эритроцитов с рубомицином в полимерном контейнере (связывание эритроцитов с доксорубицином в полимерном контейнере было исследовано ранее в нашей лаборатории). Для проверки возможного связывания рубомицина с полимерным контейнером в контейнер помещался раствор рубомицина с концентрацией 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл и 5,0 мг/мл и инкубировался при 37^оС. В течение инкубации из контейнера отбирались образцы для определения концентрации рубомицина в растворе. Для изучении кинетики связывания эритроцитов с рубомицином в контейнере полимерный контейнер, содержащий консервированную эритроцитарную массу, предварительно термостатировался в водном термостате 1 час, после чего в него вводили 70 мл физиологического раствора, содержащего 100 мг рубомицина, и полученная суспензия инкубировалась 1 час при 37 градусах. В течение инкубации из полимерного контейнера отбирались образцы суспензии, для определения содержания рубомицина в среде. Определялся гематокрит исходной массы и полученной суспензии.

4. Повреждающее воздействие рубомицина и доксорубицина на эритроциты человека.

Исследования повреждающего воздействия рубомицина и доксорубицина на эритроциты проводилось на донорских эритроцитах, выделенных из консервированной эритроцитарной массы , заготовленной на стандартном гемоконсерванте «Глюгицир». Эритроцитарную массу центрифугировали 10 минут при 1000 g и удаляли плазму и верхний слой клеток, содержащий лейкоциты и тромбоциты. После этого эритроциты трижды отмывали путем ресуспендирования в 3 кратном объеме изотонического забуференного раствора PBS (NaCl - 140mM, Na₂HPO₄ - 9mM, NaH₂PO₄ - 1.3mM, глюкоза 5mM, pH=7,4) с последующим центрифугированием 10 минут при 1000 g и удалением надосадка. Отмытые эритроциты ресуспендировались в PBS, содержащем необходимое количество антибиотика, до значения гематокрита 40-50% и суспензия инкубировалась при постоянной температуре и перемешивании до 8 часов (гематокрит суспензии (Ht) – отношение объема клеток в суспензии ко всему объему суспензии). В качестве контроля использовались эритроциты, инкубируемые в растворе PBS, не содержащем антибиотик. Для инкубации эритроцитов с доксорубицином pH инкубационного раствора снижался до значения 7,0, поскольку при больших значениях pH доксорубицин плохо растворим.

Для определения выхода гемоглобина и К+ из эритроцитов образцы суспензии центрифугировались 10 минут при 1000g. Концентрацию гемоглобина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре гемоглобина при длине волны 415 нм. Общее содержание гемоглобина в суспензии определяли по высоте пика при 415 нм в спектре водного лизата суспензии. Относительный выход гемоглобина (в %) определяли как отношение высот пиков при 415 нм в спектрах надосадочного раствора и водного лизата. Концентрацию К+ в надосадках и в водных лизатах суспензии определяли на пламенном фотометре.

Подсчет числа клеток в суспензии и определение их объема производилось кондуктометрическим методом [Руденко 1995] с помощью прибора “Coulter-Counter” (Франция).

Деформируемость эритроцитов оценивали по их фильтруемости (способности проходить по порам) путем измерения скорости протекания суспензии клеток через мембранные фильтры с цилиндрическими порами при давлении 60 мм водного столба с помощью прибора ИДА-01, представляющего собой модификацию гемореометра Хансса [Аттаул 1994 «Анализ, Лисов 1994]. Перед измерением фильтруемости эритроцитов из образцов инкубируемой суспензии отбирали пробы, эритроциты трижды отмывали раствором PBS и разбавляли раствором PBS до значения гематокрита 1 % или 0,5 %. В некоторых экспериментах суспензия эритроцитов разбавлялась раствором PBS до гематокрита 0,1 % без трехкратной отмывки. Для каждого фильтра определяли время протекания 250 мкл ресуспендирующего раствора (Tb) и суспензии эритроцитов (Ts). Для характеристики деформируемости эритроцитов использовали отношение этих времен (Tb/Ts). В работе использовали фильтры толщиной 9 мкм с диаметром пор 3 мкм. Измерения проводили при комнатной температуре (21^оС). Погрешность измерения (Тb/Ts) составляла около 10%.

Концентрацию ATP в эритроцитах определяли модифицированным люциферин-люциферазным методом [Атауллаханов 1981].

Также было исследовано влияние рубомицина на деформируемость и электрофоретическую подвижность (ЭФП) эритроцитов больных острыми лейкозами (ОЛ) при инкубации эритроцитов больных с раствором антибиотика в цельной крови больного. Деформируемость эритроцитов больных оценивали так же, как и деформируемость донорских эритроцитов, для характеристики деформируемости использовали отношение времен (Tb/Ts). ЭФП эритроцитов как характеристика электрического заряда поверхности эритроцитов определялась по скорости перемещения отдельных клеток в электрическом поле по формуле:

ЭФП=Р/(ЕТ),

где Е – напряженность электрического поля (вольт/см),

Р – расстояние, пройденное клеткой, определенное с помощью светового микроскопа (мкм),

Т – время прохождения клеткой расстояния Р (с).

Для получения достоверных результатов определялась ЭФП для 20 разных эритроцитов, вычислялось среднее значение и стандартное отклонение. Подробно методика определения ЭФП эритроцитов описана в [Козинец 1986].

5. Фармакокинетика рубомицина после введения больным с острыми лейкозами рубомицина, связанного с аутоэритроцитами.

Исследования фармакокинетики рубомицина после введения больным рубомицина, связанного с аутоэритроцитами проведены совместно с Гармаевой Т.Ц., научный консультант – д.м.н., профессор Савченко В.Г. В отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН был составлен экспериментальный протокол «Применение рубомицина, связанного с эритроцитами, у больных с резистентными формами и рецидивами острых лейкозо (I фаза )» (1997 г.) и форма информированного согласия больного на проведение лечения по данному протоколу, утвержденная в этическом комитете ГНЦ РАМН.

В данное исследование были включены 14 больных с острым лейкозом (ОЛ), из них 8 больных с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и 6 больных с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Отбор больных на проведение лечения по протоколу с применением эритроцитов-переносчиков проводился после констатации резистентности к проводимой стандартной химиотерапии или рецидива заболевания. Пол - 7 мужчин и 7 женщин. Возраст пациентов колебался от 15 до 60 лет, медиана составила 41 год.

Химиотерапия проводилась по протоколам лечения ОМЛ «7+3» (одной больной - по программе DidAC) и ОЛЛ “RACOP” [Wiernik 1992, Buchner 1992, 1992, Савченко 1997], согласно которым рубомицин вводится пациенту однократно в 1, 2, 3 дни курса в дозах 45 или 60 мг/м² на введение.

В данном исследовании 5 пациентам первые два введения рубомицина осуществлялись в виде стандартной формы препарата (раствор рубомицина), третье введение рубомицина осуществлялось в эритроцитной форме. Одному из пациентов такой курс проводили дважды. (Всего 6 введений).

9 больным все три введения рубомицина были проведены в эритроцитной форме. (Всего 27 введений).

Одной больной перед проведением курса с применением эритроцитов-переносчиков была удалена селезенка, у нее первые два введения рубомицина осуществлялись в виде стандартной формы препарата (раствор рубомицина), третье введение рубомицина осуществлялось в эритроцитной форме. (Всего 1 введение).

В качестве контроля у некоторых из этих больных была исследована фармакокинетика рубомицина при трехкратном введении стандартной формы препарата в тех же дозах.

Для приготовления эритроцитов, нагруженных рубомицином в клинических условиях была разработана специальная портативная установка (совмещающая в себе механическую качалку, полупроводниковый светоизолированный термостат для пластиковых контейнеров и полупроводниковый прибор для контроля температуры контейнера, а также весы для контроля количества взятой крови). Схема приготовления эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков в цельной крови больных и схема установки для инкубации эритроцитов с антрациклиновыми антибиотиками представлены на рис. 3. Полученный препарат эритроцитов-переносчиков рубомицина далее будет именоваться КПДА (кровь, прединкубированная с рубомицином (даунорубицином)).

Для приготовления КПДА у пациента отбиралось 300 – 400 мл крови из центрального венозного катетера в пластиковый контейнер «Гемакон» или Baxter. Во время отбора крови в контейнер осуществлялось термостатирование при 37^оС и перемешивание уже отобранной крови. Количество отобранной крови контролировалось взвешиванием.

После отбора необходимого количества крови, контейнер с кровью отсоединяли от катетера больного, катетер стандартным образом промывали и закрывали. Одновременно герметично перекрывался шланг контейнера с кровью, по которому поступала кровь в контейнер от больного. В процедурном кабинете в стерильных условиях в шланг контейнера с кровью шприцем вводилось 20 – 50 мл раствора рубомицина в физиологическом растворе, после чего шланг герметично перекрывался пережиманием корнцагом и перевязыванием. Затем контейнер помещался на качалку и инкубировался в течение 1 часа при 37^оС. После окончания инкубации приготовленный препарат КПДА вводился пациентам через центральный венозный катетр в течение 1 – 1,5 часа по процедуре, идентичной введению ресуспендированной консервированной донорской эритроцитарной массы при заместительной гемокомпонентной терапии.

Для контроля стерильности процедуры приготовления КПДА делался лабораторный бактериологический анализ проб крови из контейнера после отбора крови пациента и перед введением содержимого контейнера пациенту.

Для определения концентрации рубомицина у пациента отбирались образцы крови. При введении стандартной формы рубомицина первая проба отбиралась непосредственно после окончания введения, далее через 5, 15, 30 минут, 1, 2, 6, 18, 24 часа после окончания введения. При введении КПДА первая проба отбиралась через 30 минут после начала введения, а следующая проба – непосредственно после окончания введения, далее через 0.5, 1, 2, 6, 18, 24 часа после окончания введения КПДА. После введения КПДА в 3 день курса пробы регулярно отбирались в течение 5 – 7 дней раз в день до снижения концентрации препарата в крови до нерегистрируемого уровня. Образцы крови и плазмы (полученные путем центрифугирования крови в течение 10 минут при 1000 g ) хранились в замороженном виде при (–15^о ) – ( - 20^оС).

После завершения отбора всех проб у данного больного, образцы крови и плазмы размораживались для определения концентрации рубомицина. Концентрацию рубомицина определяли по методике, описанной выше в разделе «Методики определения антрациклиновых антибиотиков в биологических жидкостях».

6. Фармакокинетика доксорубицина после введения больным с лимфопролиферативными заболеваниями доксорубицина, связанного с эритроцитами.

Научный консультант исследования – д.м.н., профессор Пивник А.В.

В Отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии ГНЦ РАМН был составлен экспериментальный протокол "Применение доксорубицина, связанного с эритроцитами, у больных с лимфопролиферативными заболеваниями" (1996 г.) и форма информированного согласия больного на проведение лечения по данному протоколу, утвержденная в этическом комитете ГНЦ РАМН.

В данное исследование были включены 17 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями 3 и 4 стадии. Отбор больных на проведение лечения по протоколу с применением эритроцитов-переносчиков проводился после констатации резистентности к проводимой стандартной химиотерапии, рецидива заболевания или плохой переносимости стандартной формы антрациклиновых антибиотиков. Пол - 10 мужчин и 7 женщин. Возраст пациентов колебался от 16 до 75 лет, медиана составила 50 лет. Химиотерапия проводилась по протоколам химиотерапии СНОР или ABVD, согласно которым доксорубицин вводится пациенту однократно за курс, в дозах 25 или 50 мг/м² на введение.

В качестве контроля у 7 больных из экспериментальной группы и 2 больных не из экспериментальной группы была исследована фармакокинетика доксорубицина при введении стандартной формы препарата в тех же дозах (табл. ).

Для приготовления препарата доксорубицина, связанного с эритроцитами, использовали:

- аутологичную цельную кровь пациентов (в этом случае препарат будет называться КПДО – кровь, прединкубированная с доксорубицином. Осуществлено 8 введений).

- аутологичные эритроциты, выделенные из крови удалением плазмы (АЭНДО – аутоэритроциты, нагруженные доксорубицином. Осуществлено 9 введений),

- консервированные донорские эритроциты (ДЭНДО – донорские эритроциты, нагруженные доксорубицином. Осуществлено 10 введений).

Для приготовления препарата КПДО использовалась специальная портативная установка, та же, что и для приготовления КПДА (рис. 3). Процедура приготовления КПДО была идентичной процедуре приготовления КПДА.

Для приготовления АЭНДО у пациента с помощью клинической установки для плазмафереза отбиралось около 400 - 500 мл крови, плазма этой крови возвращалась пациенту сразу, а в контейнер с эритроцитами вводилось 100 - 150 мл раствора доксорубицина в физиологическом растворе. Затем контейнер помещался на качалку и инкубировался в течение 1 часа при 37^оС.

Для приготовления ДЭНДО в контейнер с консервированными донорскими эритроцитами (после проверки их совместимости с плазмой пациента) вводилось 150 - 200 мл раствора доксорубицина в физиологическом растворе. Затем контейнер помещался на качалку и инкубировался в течение 1 часа при 37^оС.

После окончания инкубации приготовленный препарат доксорубицина, связанного с эритроцитами (КПДО, или АЭНДО, или ДЭНДО) вводился пациентам через центральный венозный либо переферический катетр в течение 1 – 1,5 часа по процедуре, идентичной введению ресуспендированной консервированной донорской эритроцитарной массы при заместительной гемокомпонентной терапии.

Для определения концентрации доксорубицина у пациента отбирались образцы крови. При введении стандартной формы доксорубицина первая проба отбиралась непосредственно после окончания введения, далее через 15, 30 минут, 1, 2, 6, 18, 24 часа после окончания введения. При введении доксорубицина, связанного с эритроцитами первая проба отбиралась непосредственно после окончания введения, далее через 15, 30 минут, 1, 2, 4, 6, 8, 18, 24, 48 часов после окончания введения, далее – регулярно, до снижения концентрации препарата в крови до нерегистрируемого уровня. Образцы крови и плазмы (полученные путем центрифугирования крови в течение 10 минут при 1000 g) хранились в замороженном виде при (–15^о ) – ( -20^оС).

После завершения отбора всех проб у данного больного, образцы крови и плазмы размораживались для определения концентрации доксорубицина. Доксорубицин из образцов крови и плазмы экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К₂СО₃ и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация доксорубицина определялась спектрофлюорометрически по излучению на длине волны 588 нм при длине волны возбуждения 476 нм. Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов доксорубицина известной концентрации.

Дата добавления: 2019-02-12; просмотров: 135; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 234 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!