Определение группового состава фосфолипидного концентрата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 7Следующая ⇒

В настоящее время в виду широкого использования липидов в ряде отраслей промышленности, а также научных исследований в области производства и переработки растительных масел и жиров, биохимии, медицине, сельском хозяйстве и др., значительно возрос интерес к методам, требующим меньших материальных затрат труда, но дающих достоверные результаты.

Одним из таких методов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

При использовании метода ГЖХ для осуществляния анализа необходимо иметь неподвижную фазу и подвижную фазу-газ-носитель (азот). Разделение фракций осуществляется при высокой температуре. Наиболее точные результаты получаются при введении в хроматографическую колонку метиловых эфиров, получаемых при метилировании триацилглицеринов, фосфолипидов и других образцов.

Исследуемые образцы должны поступать в колонку в газообразном виде, для чего между дозатором и колонкой устанавливают подогреватель, обеспечивающий мгновенное испарение образца. Температура в подогревателе должна быть на 30...50⁰С выше температуры в колонке.

В методе ВЭЖХ образец вводится в виде раствора, разделение происходит при комнатной температуре. Образец может быть в нативном состоянии или в препарированном виде. Большое влияние на результат анализа имеет выбор растворителя, который должен обеспечить прозрачность раствора и хорошее разделение образца на составляющие компоненты.

Для качественного определения группового состава необходимо знать время удерживания t_i отдельных компонентов.

Для определения t_iпрепаративно выделяют индивидуальные группы методом ТСХ или на колонке с силикагелем и пропускают их растворы через жидкостной микроколоночный хроматограф Милихром. После определения t_i для количественного определения группового состава образца необходимо рассчитать поправочный коэффициент К_i для каждой группы.

По известным t_i и К_i будут идентифицированы рабочие хроматограммы.

При известных значениях t_i и К_i метод ВЭЖХ является удобным для использования по сравнению с ГЖХ и ТСХ, менее трудоемким и более точным.

Принцип метода. Известны способы разделения и количественного определения фосфолипидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) как в виде их производных, так и в нативном состоянии. Первый способ имеет существенные недостатки, в частности, при получении дифенилкарбонильных производных модифицированию подвергаются не все фосфолипиды, процесс получения нитробензоатов трудоемок и длителен.

Большое распространение получило второе направление-исследование фосфолипидов в нативном состоянии. Разделение происходит за счет разной полярности групп фосфолипидов.

Методом ВЭЖХ можно определять групповой состав, непосредственно взяв для анализа концентрат, если содержание масла в нем не превышает 50 %, так как в этом случае масло на точность анализа не влияет. Если содержание масла в фосфолипидном концентрате превышает 50 %, или анализируемым образцом является растительное масло, в котором определяют групповой состав входящих в него фосфолипидов, то необходима дополнительная операция по отделению нейтральных липидов.

Для анализа используют жидкостной микропленочный хроматограф Милихром, работающий при комнатной температуре.

Особые требования предъявляют к растворителю, используемому для приготовления анализируемых растворов. Он должен быть сухим и перегнанным. Чистоту проверяют методом ВЭЖХ.

Отвечающий требованиям хлороформ при приготовлении анализируемых растворов фосфолипидов удовлетворяет по прозрачности в области регистрируемых длин волн и дает хорошее разделение фосфолипидов на группы.

Приборы: весы лабораторные 2-го класса точности; жидкостной микропленочный хроматограф Милихром; колонка для хроматографии размером 2х60 мм, эффективность 3...5 тыс. теоретических тарелок; автоматический потенциометр или другой регистрирующий прибор с электрическим входом 100 мВ; отгонная установка, вакуумная.

Реактивы: Силасорб-600 с размером частиц 3...5 мкм; ацетонитрил для жидкостной хроматографии ОП-3, “ОСЧ” для хроматографии; метанол “ОСЧ” для хроматографии; гексан “ОСЧ” для хроматографии; кислота фосфорная (орто) “ХЧ”; этанол ректификованный технический; йод металлический; хлороформ; вода дистиллированная.

Химическая посуда: стаканчики для взвешивания, вместимостью 10 см³; пипетки вместимостью 1 см³; эксикатор.

Техника выполнения. Анализ начинают с проверки чистоты хлороформа, используемого в качестве растворителя для анализируемого образца.

Для этого при условиях анализа вводят в хроматограф 5 мкл чистого хлороформа. Отсутствие пиков, кроме пика, соответствующего хлороформу с временем удерживания 1,5...2 мин, стабильность нулевой линии и отсутствие шумов, превышающих 2...4 мВ, говорят об удовлетворительной чистоте растворителя. Регистрацию хроматограммы производят УФ датчиком при длине волны 204 нм, при которой имеются самые высокие пики, а следовательно, и наибольшую чувствительность датчика.

В качестве неподвижной фазы используют Силасорб-600 с размером частиц 5 мкм. Колонка размером 2х60 мм имеет эффективность 3...5 тыс. теоретических тарелок.

Подвижная фаза - элюент состава ацетонитрил – метанол - 85 %-ная ортофосфорная кислота в соотношении 780 : 10 : 9, скорость расхода 200мкл/мин.

В приборе использован УФ детектор с переменной длиной волны, работающий при 204 нм, чувствительность датчика 0,8, быстродействие 0,15 с. Объем пробы для анализа 5 мкл.

Запись хроматограмм осуществляют автоматическим потенциометром или каким-либо другим регистрирующим прибором, например, интегратором с электрическим входом 100 мВ.

На лабораторных весах в пробирку с пробкой на шлифе взвешивают навеску фосфолипидного концентрата 10±0,1 мкг и растворяют в 1 см³ хлороформа.

Перед вводом пробы колонку промывают элюентом несколькими объемами шприца насоса при скорости расхода 200 мкл/мин до установления стабильной нулевой линии.

Ввод пробы осуществляют с помощью иглы-дозатора, предусмотренного в приборе.

После 8...10 измерений колонку промывают (гексаном, несколькими объемами шприца насоса).

Для качественного анализа или расшифровки полученных хроматограмм используют время удерживания для индивидуальных групп фосфолипидов t_i, рассчитанных по хроматограммам соответствующих стандартных растворов химически чистых индивидуальных групп.

Для количественного расчета хроматограмм необходимо также знание поправочного коэффициента К_i, который рассчитывают как отношение навески, взятой для приготовления стандартного раствора, к площади хроматографического пика.

Время удерживания и поправочные коэффициенты для отдельных групп фосфолипидов определены экспериментально и представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Параметры качественного и количественного анализа фосфолипидов

Группы фосфолипидов	Время удерживания t_i, мин	Поправочный коэффициент K_i, мкг/м^3.с
Фосфатидилинозитолы	3,5	0,090
Фосфатидилсерины	4,5	0,012
Фосфатидилэтаноламины	8,0	0,003
Фосфатидилхолины	11,5	0,026
Лизофосфатидилхолины	27,0	0,060

По экспериментальной хроматограмме, после определения площади пиков S_i отдельных групп фосфолипидов, производят расчет суммарной доли фосфолипидов в фосфолипидном концентрате С_фл в % по формуле (8)

, (8)

где S_i-площадь соответствующего пика на хроматограмме, мВ^.с;

К_i- поправочный коэффициент индивидуальной группы

фосфолипидов, мкг/мВ^.с;

С-масса навески фосфолипидного концентрата, мг;

V-объем вводимой пробы, мкл.

Определение площадей пиков индивидуальных групп фосфолипидов можно определить также по клеточкам с учетом параметров регистрирующего прибора.

Расчет массовой доли в процентах индивидуальных групп фосфолипидов С_i проводят по формуле (9)

(9)

Метод применим при проведении исследовательских работ.

Лабораторная работа № 4

Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 998; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

⇐ Предыдущая 1 2 3 4 567 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!