Определение состава липидов в жировых продуктах методом тонкослойной хроматографии
Аппаратура и химическая посуда: весы лабораторные 2-го и 4-го классов точности; шкаф сушильный, стеклянные пластинки размером 5х20, 10х20, 20х20 см со слоем силикагель-гипс; микрошприц; хроматографическая камера; колба вместимостью 10 и 20 см3; пульверизатор; эксикатор; цилиндр измерительный вместимостью 25 см3.
Реактивы, материалы: хлороформ; эфир петролейный; эфир диэтиловый; кислота ледяная уксусная; йод кристаллический; кислота фосфорномолибденовая, 5-20 %-ный раствор в 96 % этаноле; свидетели-метчики.
Техника выполнения: Метод основан на том, что пробу липидов, нанесенную на пластинку со слоем силикагель – гипс, разделяют в системе растворителей в определенном соотношении с последующей идентификацией полученных пятен.
Перед нанесением пробы на расстоянии 10...20 мм от края пластинки острым шпателем проводят черту- стартовую линию. От этой линии вверх по пластинке отмеряют 10...15 см. Это фронт-расстояние продвижения растворителя.
Пробу липидов около 0,5 г растворяют в 10 см3 хлороформа для получения 4...5 %-ного раствора и микрошприцем наносят в виде отдельных точек, расстояние между которыми должно быть 1,5 см.
Диаметр пятна должен быть по возможности небольшим, так как по мере развития хроматограммы площадь, занимаемая им, возрастает. Кроме того, при нанесении слишком больших количеств вещества при проявлении могут образовываться хвосты, затрудняющие идентификацию хроматограммы. В каждом пятне должно содержаться по 0,5...2 мкл хлороформенного раствора, что составляет 20...80 мкг липидов.
|
|
|
После нанесения образца растворителю дают испариться на воздухе.
Для разделения нейтральных липидов (жиров и масел) чаще всего используют следующую систему растворителей: петролейный эфир – диэтиловый эфир – уксусная кислота в соотношении 90:10:1 или 80:20:1.
Пластинки с нанесенным образцом помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную парами растворителя, в вертикальном или слегка наклонном положении (угол наклона не более 200) так, чтобы растворитель не смачивал стартовую полоску и она была бы на 5...6 мм выше уровня жидкости в камере.
Хроматографирование считается законченным, когда фронт растворителя поднимется на 10...15 см в течение 30...40 мин.
Универсальным индикатором для проявления пятен являются пары йода. Для этого кристаллы йода помещают на дно эксикатора и оставляют на несколько часов. Пластинку с разделенными фракциями после испарения растворителя помещают в эксикатор на 20...30 с. Адсорбируясь на поверхности пятен, пары йода окрашивают их в коричневый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации и природы вещества в пятне. Окрашенные пятна быстро обводят по границам иглой, чтобы зафиксировать их положение, так как коричневая окраска через некоторое время исчезает и пятна обесцвечиваются.
|
|
|
В качестве проявителя используют также и фосфорномолибденовую кислоту в виде 5...20 %-ного раствора в 96 %-ном этаноле. Для этого высушенную хроматограмму после испарения растворителя опрыскивают с помощью пульверизатора раствором фосфорномолибденовой кислоты; пластинку помещают в сушильный шкаф при температуре 50...600С, через несколько минут нейтральные липиды обнаруживаются в виде окрашенных пятен на голубом фоне.
Идентификацию проводят по значению Rf. В таблице 7.1 приведены последовательности вымывания составляющих липидов и соответствующие Rf.
Если требуется установить количественное содержание вещества в пятнах, то проводят денситометрическое определение.
Более точные результаты идентификации получают путем нанесения на пластинку рядом с пробой исследуемого вещества пробу свидетеля (метчика)-индивидуально чистого компонента.
Такой способ используют при проведении научных исследований. Если расстояние от линии старта центра пятна свидетеля и соответствующего компонента разделяемой смеси будет одинаковым, то это подтверждает наличие такого соотношения в смеси.
|
|
|
Таблица 1.1 – Последовательность вымывания составляющих липидов и соответствующие Rf
| Класс липидов | Rf при системе растворителей петролейный эфир – диэтиловый эфир – уксусная кислота | |
| 90:10:1 | 80:20:1 | |
| Углеводороды (парафины и олефины) | 0,9-1,0 | 0,98 |
| Свален | 0,95 | 0,98 |
| Каротиноиды | - | - |
| Триалкиловые эфиры глицерина | 0,9 | 0,85 |
| Эфиры стеринов | 0,9 | 0,94 |
| Воски | 0,9 | 0,88 |
| Метиловые эфиры жирных кислот | 0,65 | 0,77 |
| высшие алифатические альдегиды | 0,55 | 0,73 |
| Витамин К | 0,55 | - |
| Триацилглицерины | 0,3-0,4 | 0,60 |
| a-токоферол | 0,19 | - |
| Жирные кислоты | 0,18 | 0,39 |
| Высшие алифатические спирты | 0,15 | 0,30 |
| Стерины | 0,10 | 0,19 |
| Диацилглицерины | 0,08 | 0,15-0,21 |
| Моноацилглицерины | 0,00 | 0,02 |
Фосфолипиды остаются на старте.
Абсолютная величина Rf может меняться в зависимости от температуры, влажности, типа камеры и т.д., но относительный порядок подвижности соединений всегда один и тот же.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 495; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!