Фракционное осаждение и экстракция
Эти методы применяются для выделения и очистки практически всех природных полисахаридов.
Экстракция
Экстракция является первоначальной стадией почти каждого процесса выделения. Экстракция используется для:
- растворения полисахарида и ряда сопутствующих веществ (многочисленные примеси остаются нерастворимыми в исходном сырье);
- удаления сопутствующих веществ (извлекаемый полисахарид представляет собой остаток после экстракции);
Последним способом получают, например, целлюлозу из растительного материала и хитин из панцирей ракообразных.
Растворителем, применяемым для экстракции выделяемого полисахарида прямым растворением, в подавляющем большинстве случаев является вода. Повышение растворение может быть достигнуто повышением температуры, изменением pH среды. Так, многие кислые полисахариды, находящиеся в природном сырье в солевой форме, хорошо растворяются в разбавленных минеральных кислотах. Растворимость нейтральных полисахаридов, наоборот, повышается в щелочной среде. Иногда при экстракции полисахаридов используют растворы солей, например растворы тиоцианата лития, или растворы комплексообразователей, например солей борной кислоты. В специальных случаях полисахариды извлекают другими растворителями - водным спиртом, диметилсульфоксидом, диметилформамидом. С помощью этих растворителей часто удается избирательно экстрагировать полисахариды со сравнительно невысокой молекулярной массой или с большим количеством малополярных заместителей, например ацетатных групп.
|
|
|
Экстракция полисахарида сопровождается растворением полярных низкомолекулярных соединений - неорганических солей, сахаров, гликозидов, а также ряда белков, нуклеиновых кислот и т.д. Поэтому дальнейшая обработка экстракта проводится с целью удаления этих сопутствующих веществ.
Осаждение
Некоторые полисахариды растворимы в горячей воде значительно лучше, чем в холодной, и их отделяют после охлаждения экстрактов. Дальнейшая очистка таких полисахаридов аналогична перекристаллизации.
Другим приемом выделения полисахаридов из водных растворов является осаждение смешивающимся с водой органическим растворителем, например этиловым спиртом. В 80%-ом спирте растворимы многие низкомолекулярные вещества с полисахаридами, например, моно- и олигосахариды. Полисахариды при такой концентрации спирта, как правило, выпадают в осадок. В качестве осадителей применяют также метанол, ацетон, уксусную кислоту.
Простое осаждение не приводит к разделению смесей полисахаридов. Чтобы отделить полисахариды друг от друга, проводят фракционное осаждение, т.е. получают серию фракций осаждаемых веществ, соответствующих разным концентрациям осадителя в растворе, и исследуют их свойства и состав.
|
|
|
При фракционном осаждении полисахаридов используются следующие осадители: неорганические соли (соли аммония, кальция, бария, калия, рубидия, цезия), кислоты, щелочи, органические спирты (этанол), кетоны (ацетон). Осадитель медленно добавляют в разбавленный раствор полимера при перемешивании.
Так, кислые полисахариды могут быть выделены из растворов и отделены от нейтральных полисахаридов в виде нерастворимых солей. Например, для осаждения альгиновой и пектовой кислот используют кальциевые или бариевые соли.
Для осаждения и фракционирования полисахаридов используют также низко- и высокомолекулярные комплексообразователи. Осаждение амилозы в виде комплекса с н-бутанолом – обычный прием разделения крахмала на амилозу и амилопектин.
В результате осаждения полисахаридов из первичных экстрактов часто получают смеси, загрязнённые неуглеводными примесями, в первую очередь белком и неорганическими солями, поэтому необходимо подвергнуть экстракт предварительной обработке посредством диализа, ультрафильтрования или ферментативной очистки.
|
|
|
Фильтрование, ультрафильтрование, диализ.
Фильтрование – механическое просеивание раствора полисахарида через фильтр для удаления грубодисперсных частиц (размером более – 1 мк). Для фильтрования используют бумажную ткань, фильтровальную бумагу, стеклянную вату, туфовые стеклянные фильтры.
Первичные экстракты полисахаридов, как правило, загрязнены неуглеводными примесями: неорганическими солями, белком и др. Для их удаления применяют ультрафильтрование, диализ и аналогичные методы.
Ультрафильтрование – фильтрование растворов через полупроницаемые мембраны с известной величиной пор (0,01 – 1 мк). Традиционными материалами для ультрафильтрования являются целлофан и нитроцеллюлоза. Пример промышленного аппарата для ультрафильтрации приведен на рис. 1.
Рис. 1 Аппарат для ультрафильтрования (поставляется фирмой Amicon Inc, Beverly, MA). Под давлением азота из баллона раствор полисахарида фильтруется через мембрану. Небольшие молекулы проходят через мембрану и собираются при выходе. Крупные молекулы остаются в камере
Ультрафильтрование позволяет удалить низкомолекулярные примеси, сконцентрировать раствор полимера, а в отдельных случаях. Получить фракции полисахаридов, различающихся молекулярной массой. Ультрафильтрация является исключительно эффективным способом подготовки образцов для дальнейших исследований., например, для последующей хромотографии.
|
|
|
Диализ применяется для отделения низкомолекулярных примесей: электролитов (ионов натрия, сульфата, аммония, хлорида и др.) Для изготовления диализных полупроницаемых мембран используют целлофан. Растворы полисахаридов, требующие очистки, помещают в целлофановые сосуды, которые погружают в воду. При этом низкомолекулярные примеси диффундируют через поры целлофановой мембраны в водную среду. Процесс диффузии ускоряется при перемещении диализуемого раствора и диализе против проточной воды. Для удаления катионов из растворов кислых полисахаридов диализ проводят в подкисленных растворах.
Для быстрого удаления электролитов может быть применен электродиализ, при котором диффузия ионов ускоряется под действием электрического поля (рис.2).
Рис. 2 Электродиализер: электроды (1); мембрана (2); отделение, содержащие очищаемый раствор полисахарида (3).
Постоянный ток пропускают через раствор полисахарида, отделенный от воды полупроницаемой мембраной.
Электрофорез
Электрофорез является важным методом разделения смесей полисахаридов, хотя широкому его использованию препятствует трудность подбора условий эффективного разделения.
Для анализа смесей кислых полисахаридов применяется электрофорез в аппарате Тизелиуса. Таким путем, например, отделяют сульфатированные полисахариды водорослей от полиуронидов. Разделение нейтральных полисахаридов проводят в боратном буфере в условиях, при которых полисахариды различаются способностью образовывать комплексы с борной кислотой. Таким образом, удалось отделить маннан от глюкана в водорастворимой фракции полисахаридов Candida albicans.
Боратный буфер используют и для электрофореза полисахаридов на бумаге. Однако в этом случае возникают трудности, связанные с обнаружением полисахаридов и их взаимодействием с целлюлозой. Для преодоления этих трудностей в качестве носителя может быть использована бумага из стекловолокна. В качестве электролита в данном случае используют 2 Н раствор едкого натра. Для обнаружения полисахаридов используют реактив Милоша или щелочной раствор перманганата калия. Данным методом была установлена гетерогенность многих препаратов полисахаридов, например ряда галакто- и глюкоманнанов, пентозанов. Препаративный вариант этого метода был успешно использован при выделении сложного гетерополисахарида из одноклеточной зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa .
Ферментативная обработка
Ферментативная обработкаразрушает высокомолекулярные примеси, которые не удаётся удалить при помощи диализа. Очистка раствора от использованного фермента осуществляется одним из методов денатурации белков: нагревание, действие химических реагентов (щёлочи, трихлоруксусной кислоты, хлороформа с амиловым спиртом и т.д.), избирательная сорбция белков на геле фосфата кальция. Эти же методы применяются для деструкции неферментных белков, загрязняющих раствор.
Хроматография
Хроматография - разделение веществ, различающихся по определённым физико-химическим параметрам.
Вид хроматографии, основанный на разделении веществ по молекулярному весу - гель-фильтрация на сефандексе. Сефандекс - полусинтетический сорбент полисахаридной природы; его гранулы содержат поры и формируют т. н. “молекулярное сито”, которое задерживает внутри низкомолекулярные вещества и не препятствует диффузии полимеров. Существуют наборы сефандексов с различной величиной пор для разделения смеси полисахаридов. Таким способом получают декстраны.
Ионообменная хроматография позволяет разделить вещества в соответствии с их зарядом (например, отделить кислые полисахариды от нейтральных). Ионообменник - это твёрдый носитель заряженных групп, которые способны за счёт электростатистического взаимодействия связывать ионы исследуемых молекул. Таким образом, заряженные молекулы обратимо адсорбируются ионообменником и могут быть элюированы для дальнейшей обработки.
Распределительная и адсорбционная хроматография не нашли широкого применения в области получения полисахаридов.
Распределительная хроматография выявляет разную подвижность исследуемых веществ при распределении последних между двумя фазами, стационарной (матрикс = носитель = сорбент) и мобильной (растворитель = проявитель). Адсорбционная хроматография может разделить вещества в том случае, если при одинаковых концентрациях они демонстрируют разную степень связывания с сорбентом. Трудности, которые возникают при использовании данных видов хромтографии при работе с растворами полисахаридов, обусловлены склонностью последних к межмолекулярной ассоциации и образованию коллоидных растворов.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 1416; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!