Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов
Нуклеиновые кислоты присутствуют во всех клетках (за исключением эритроцитов) организма человека в виде комплекса с белками, т.е. образуют нуклеопротеиды. Они в большом количестве содержатся в селезенке, зобной железе, печени и других органах и тканях, богатых ядрами. Из этих органов проще выделять и изучать нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты. Нуклеопротеиды делятся на дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП) и рибонуклеопротеиды (РНП), в которых фосфатные группы ДНК или РНК электростатически взаимодействуют с белками. Нуклеиновые кислоты – высокомолекулярные соединения, состоящие из мононуклеотидов, соединенных 3’, 5’- фосфодиэфирными связями. Они плохо растворимы в воде, образуя вязкие гелеподобные растворы. Хорошо растворимы в щелочах, растворах минеральных кислот и солей.
Реактивы. Хлорид натрия, 5%-ный раствор, содержащий 0,04% трехзамещенного цитрата натрия; гидроксид натрия, 0,4%-ный раствор; дифениламиновый реактив*; биуретовый реактив*.
Оборудование. Штатив с пробирками; ступка с пестиком; стеклянный порошок; пипетки; мерные цилиндры вместимостью 50 и 300 мл; пипетки вместимостью 1 мл; кристаллизатор; деревянные палочки с насечками; водяная баня; круглодонная колба с обратным холодильником; марля для фильтрования.
Материал.
1. Селезенка, свежая или замороженная.
2. Выделенный из селезенки дезоксирибонуклеопротеид.
3. РНК дрожжевая, свежеприготовленный 0,1%-ный раствор.
|
|
|
а. Выделение дезоксирибонуклеопротеида из ткани селезенки. Метод основан на способности дезоксирибонуклеопротеидов растворяться в солевых растворах большой ионной силы и выпадать в осадок при снижении их концентрации.
Ход определения. 2/3 г ткани селезенки тщательно растирают в ступке со стеклянным порошком, приливая постепенно небольшими порциями 35-40 мл раствора хлорида натрия. Полученный вязкий раствор фильтруют через 2 слоя марли в малый кристаллизатор.
Отмеряют цилиндром шестикратный (по отношению к фильтру) объем дистиллированной воды и медленно выливают ее в фильтрат. Образовавшиеся нити дезоксинуклеопротеида осторожно наматывают на деревянную палочку, переносят в пробирку для использования в последующей работе.
б. Качественная реакция на ДНК (реакция Дише). Метод основан на способности дезоксирибозы, входящей в ДНК дезоксирибонуклеопротеида, образовывать соединение синего цвета с дифениламином при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной и концентрированной серной кислот. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание.
Ход определения. К ¼ части осадка дезоксирибонуклеопротеида приливают 1 мл 0,4%-ного раствора гидроксида натрия (до растворения). Добавляют 0,5 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 15-20 мин.
|
|
|
Аналогичную реакцию выполняют в другой пробирке с 1 мл раствора РНК. Отмечают характерное окрашивание в пробах.
в. Выявление белкового компонента дезоксирибонуклеопротеида (ДНП). Метод основан на биуретовой реакции (описана в работе 1).
Ход определения. Переносят часть полученных ранее нитей ДНП в пробирку, добавляют 0,5 мл раствора гидроксида натрия до растворения нитей и 5 капель биуретового реактива. Наблюдают за появлением окрашивания.
г. Гидролиз дезоксирибонуклеопротеидов.
Ход определения. Оставшуюся часть осадка дезоксирибонуклеопротеидов, полученных из ткани селезенки, помещают в колбочку для гидролиза, добавляют 30-40 мл 5%-ного раствора серной кислоты.
Закрывают колбочку пробкой с обратным холодильником и осторожно кипятят содержимое на асбестовой сетке на медленном огне в течение 30-40 мин. Полученный гидролизат охлаждают и используют для определения составных компонентов ДНК в последующей работе (гидролизат хранить в холодильнике).
Оформление работы. В выводе отметить возможность выделения нуклеопротеидов с помощью солевых растворов и их идентификации с помощью реакций на нуклеиновый компонент.
|
|
|
Практическое значение работы. Выделение и очистку дезоксирибонуклеопротеидов из гомогенатов и ядер клеток с помощью растворов хлорида натрия разной концентрации используют в экспериментальной биохимии. Дифениламиновая проба лежит в основе методов качественного и количественного определения нуклеопротеидов и нуклеиновых кислот в биологическом материале. В клинической цитологии эти реакции применяют при нативной окраске нуклеиновых кислот, например, в мазках клеток крови.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
При гидролизе нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты распадаются на составные части. Обнаружение и методы количественного определения нуклеиновых кислот и их мономеров (нуклеотидов) в биологическом материале и препаратах основаны на особенностях химической природы этих соединений.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 431; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!