Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов
Гликопротеиды – это сложные белки, содержащие углеводный компонент. Он составляет, как правило, примерно 10-20% от массы всей макромолекулы. Исключение представляют так называемые вещества групп крови, содержащиеся в эритроцитах. У этих гликопротеидов углеводная часть составляет до 80% от массы макромолекулы.
В гликопротеидах углевод с белком соединен ковалентной связью. В состав небелкового фрагмента гликопротеидов входят разнообразные моносахариды и их производные: глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза, арабиноза, фукоза, рамноза, глюкозамин, ацетилглюкозамин, нейраминовая кислота, глюкуроновая кислота и др.
Гликопротеиды широко распространены в организме человека и животных и выполняют многочисленные биологические функции. Например, гликопротеидами являются транспортные белки плазмы (гаптоглобин, трансферрин, транскортин и др.), факторы свертывания крови (протромбин, фибриноген), иммуноглобулины, ферменты (холинэстераза, рибонуклеаза В), гормоны (гонадотропины, кортикотропин). Эта группа сложных белков содержится во внутрисуставной жидкости, где они выполняют механическую функцию. Гликопротеиды входят в состав слизистых секретов – слюны, желудочного и кишечного соков, облегчая движение пищи по кишечнику.
Особенность моносахаридного состава углеводной части гликопротеидов определяет методы их качественного и количественного анализа.
|
|
|
Реактивы. Уксусная кислота, конц.; α-нафтол, 1%-ный спиртовой раствор; серная кислота, конц.
Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки; пипетки вместимостью 5 мл; стеклянные палочки; фильтровальная бумага.
Материал.
1. Слюна (для получения слюны прополаскивают ротовую полость водой, затем набирают в рот 10 мл дистиллированной воды и держат ее около 2 мин, смешивая с выделяющейся слюной. Жидкость выпускают в стаканчик, профильтровывают через марлю и используют для исследования).
2. Кортикотропин, во флаконах.
3. Хорионический гонадотропин, в ампулах.
 |
Метод основан на способности гидроксиметилфурфурола, образующегося из гексоз гликопротеидов под влиянием концентрированной серной кислоты, давать с α-нафтолом продукт конденсации красно-фиолетового цвета:
Ход определения. В пробирку вносят 2 мл слюны и прибавляют по каплям половинный объем концентрированной уксусной кислоты, помешивая содержимое стеклянной палочкой. Муцин слюны осаждается в виде комочка. Жидкость осторожно сливают, придерживая комочек муцина стеклянной палочкой. Обсушивают сгусток полоской фильтровальной бумаги.
К муцину добавляют 10-20 капель спиртового раствора α-нафтола и по стенке пробирки, наклонив ее, осторожно наслаивают 20 капель концентрированной серной кислоты. Образуется окрашенное кольцо. При осторожном встряхивании пробирки постепенно окрашивается ее содержимое.
|
|
|
Ту же реакцию, что и с муцином, проделывают с препаратами кортикотропина и хорионического гонадотропина, используя для этих целей по 5 капель исследуемых веществ.
Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.
| Вещество | Реакция | Наличие окраски |
В выводе отметить наличие соответствующих простетических групп в изучаемых объектах.
Практическое значение работы. Качественные реакции на простетическую группу гликопротеидов используются для выявления их в различном биологическом материале и лекарственных препаратах. Эти реакции лежат в основе методов количественного определения гликопротеидов.
Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды
(на примере казеина молока)
Простетической группой фосфопротеидов является остаток фосфорной кислоты, который эфирной связью соединен с гидроксилом серина или треонина белковой части. Фосфорная кислота составляет 0,4-0,9% от массы молекулы фосфопротеида. К фосфопротеидам относятся казеиноген (казеин) молока, вителлин, вителленин и витин яичных желтков, ферменты – фосфорилаза, фосфоглюкомутаза и многие другие.
|
|
|
Казеиноген является полноценным белком, содержащим все незаменимые аминокислоты. В молоке он связан не только с остатком фосфорной кислоты, но и с ионами кальция. Свертывание молока при подкислении объясняется выпадением осадка казеиногена. Под действием пищеварительных ферментов (пепсин, химозин) казеиноген превращается в казеин, что сопровождается свертыванием (створаживанием) молока.
Присутствие фосфопротеидов в материале можно обнаружить реакциями на фосфаты.
Реактивы. Биуретовый реактив*; молибдат аммония в азотной кислоте*; азотная кислота, конц.; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 1 М растворе соляной кислоты.
Оборудование. Весы аптечные с разновесом; штатив с пробирками; стеклянные палочки; пипетки вместимостью 5 мл; водяная баня.
Материал. Казеин, сухой порошок.
Метод основан на обнаружении в гидролизатах казеина белкового компонента по биуретовой реакции, а фосфорной кислоты – по реакции с молибдатом аммония, в результате которой образуется фосфомолибденовый комплекс:
|
|
|
H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3(PO4∙12MoO3) + 21NH4NO3 + 12H2O
молибдат фосфомолибдат аммония
аммония
Под действием восстановителей (аскорбиновая кислота) фосфомолибдат аммония переходит в молибденовую синь.
Ход определения. В пробирку отвешивают 0,1 г сухого порошка казеина. Добавляют 5 мл раствора гидроксида натрия и ставят в кипящую водяную баню на 30 мин.
После охлаждения отбирают в пробирку 10 капель гидролизата и проводят реакцию с биуретовым реактивом, добавляя его 3-5 капель. Отмечают появление характерного окрашивания.
В другую пробирку вносят 20 капель гидролизата и нейтрализуют его, прибавляя по каплям концентрированную азотную кислоту до слабой реакции (по лакмусовой бумаге, кусочек которой заранее помещают в пробирку). Затем добавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое встряхиванием и наливают 10 капель раствора аскорбиновой кислоты. Вновь перемешивают и оставляют стоять пробы до развития специфического окрашивания.
Оформление работы. Отметить результат проведенных качественных реакций, в выводе указать химическую природу казеина молока.
Практическое значение работы. Качественные реакции на фосфатную группу используются для обнаружения фосфопротеидов в исследуемых образцах.
Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот
в сыворотке крови методом Гесса
Реактивы. Раствор трихлоруксусной кислоты, 10%-ный раствор; уксусно-сернокислый реактив (95 мл ледяной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты).
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1,0; 5,0; центрифуга; водяная баня; ФЭК.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на способности нейраминовой кислоты, освобождающейся при гидролизе сывороточных гликопротеидов, образовывать окрашенные соединения при нагревании с уксусно-сернокислым реактивом.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1,0 мл сыворотки крови и добавляют 1,0 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку помещают в кипящую водяную баню точно (!) на 5 минут. Охлаждают под струей воды в течение 5 минут. Встряхивают и центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин. Отбирают 0,4 мл надосадочной жидкости, переносят в пробирку, наливают 5,0 мл уксусно-сернокислого реактива и помещают на 30 минут в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры и интенсивность окраски определяют на ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной 10 мм против контроля. Контролем служит уксусно-сернокислый реактив.
Расчет. Определите количество сиаловых кислот по калибровочному графику и рассчитайте содержание по формуле:
а∙5∙100
Х = ————— ,
1000∙1000
где а – содержание сиаловых кислот в исследуемой пробе в мкг, найденное по калибровочному графику;
5 – расчет на 1 мл сыворотки;
1000 (в числителе) – для перевода на 1 л сыворотки;
1000 (в знаменателе) – для пересчета в мг и г.
Оформление работы. По полученным значениям экстинкций сделать расчет содержания сиаловых кислот в г/л. Пересчитать их содержание в ммоль/л согласно формуле:
а∙103
Х = ———— ,
309
где а – количество сиаловых кислот в г/л;
103 – перевод г в мг;
309 – молекулярный вес сиаловых кислот.
Практическое значение работы. В норме содержание сиаловых кислот в сыворотке крови колеблется от 2,0 до 2,36 ммоль/л (0,62-0,73 г/л). Их количество значительно возрастает при заболеваниях, связанных с деструкцией соединительной ткани, при туберкулезе, инфаркте миокарда, опухоли головного мозга. Снижение содержания отмечается при пернициозной анемии, болезни Вильсона, дегенеративных процессах центральной нервной системы.
Дата добавления: 2018-11-24; просмотров: 504; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!