Рост стафилококка на желточно-солевом агаре.
Для приготовления 20% желточно-солевой агар к 100 мл расплавленного и остуженного до 600С мясо-пептонного агара (рН=7.2) с 10% хлорида натрия прибавляют 20 мл взвеси желтка куриного яйца в стерильном физиологическом растворе. На желточно-солевом агаре обнаруживается лецитовителлазная активность (ЛецА) (способность разрушать лецитовителлин яичного желтка) испытуемых микроорганизмов. Результат оценивается после 24 часовой инкубации в термостате при 370С по образованию вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком. Учитывают в отраженном свете
Персистентные свойства микроорганизмов – антилизоцимная активность (АЛА).
АЛА – секреторный фактор персистенции. Изучают АЛА по методике О.В. Бухарина с соавт. (1984). Для этого к 1,5% питательному агару добавляют различные дозы яичного лизоцима (от 1 до 5 мкг) и разливают в чашки Петри. После застывания среды на подсушенную поверхность наносят каплю 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры изучаемого микроорганизма. Чашки инкубируют в термостате при 370С 24 часа, после этого выросшие колонии подвергаются обработке парами хлороформа в течение 20 минут, затем наслаивается слой 0,7% питательного агара с 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича) чувствительной к литическому действия лизоцима. Учет результатов проводится через 24 часа инкубации в термостате по наличию зоны роста микрококка вокруг тех штаммов, которые нейтрализуют внесенный в слой агара яичный лизоцим. Антилизоцимную активность выражают в мкг инактивированного в среде лизоцима.
|
|
|
На данной чашке видны колонии АЛА+ и АЛА- штаммов микроорганизмов. Над колониями АЛА+ штаммов есть рост микрококка в виде мелких желтых колоний.
Лизоцимная активность.
Лизоцим –термостабильный белок, фермент, разрушает клеточную стенку преимущественно грамположительных бактерий, разрывая β-гликозидные связи между аминосахарами пептидогликана, что способствует образованию протопластов с последующим их лизисом. Содержится во всех тканевых жидкостях, в лейкоцитах, макрофагах и других фагоцитирующих клетках. Продуцируется лизоцим преимущественно клетками моноцитарно/макрофагального ряда. Лизоцим усиливает антибактериальную активность комплекса антиген (микроб)-антитело-комплемент, способствуя лизису пептидогликана клеточной стенки бактерий. Помимо животного раличают растительный и микробный лизоцим.
Микробный лизоцимявляется одним из факторов колонизации. Лизоцимная активность (ЛА) определяется путем посева исследуемой культуры микроорганизма на питательную среду, содержащую 1 млрд. суспензию суточной агаровой культуры Micrococcus luteus (lysodeikticus) АТСС 15307 (ГИСК им. Тарасевича). Результат оценивается после инкубации при 370С в течение суток по зоне лизиса в толще среды индикаторного штамма микрококка вокруг изучаемых колоний.
|
|
|
Иммуноферментный метод
Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.
ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.
Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.
|
|
|
Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.
Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.
Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: [AT]+[АГ]↔[АТАГ]
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
|
|
|
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;
2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Принципальная схема иммуноферментного анализа для выявления АТ является следующей. Известный АГ (вирус, белок) – диагностикум фиксируется на твердой фазе. К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными АТ. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему АТ, если таковые имелись в сыворотке обследуемого. Для обнаружения комплекса АГ-АТ, к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки иммунизируют кролика глобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в обследуемой сыворотке есть АТ к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки. После второй промывки образовавшийся комплекс АГ+АТ+АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат на фермент (перекись водорода) и индикатор на продукты расщепления субстрата (хромоген на активные формы кислорода). Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых АТ в сыворотке обследуемого.
Среда Китта-Тароцци.
Питательный бульон с глюкозой и кусочками свежих органов животных. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Сверху среду заливают слоем стерильного масла, которые не пропускает кислород из воздуха в среду. В результате создаются условия для культивирования анаэробных микроорганизмов.
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 940; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!