Микроскопия исследуемого материала

Ответы по практическим навыкам. Микрохренология

1. Мазок из культуры микроорг.,выращ.на плотной пит.среде
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.

Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.

2...выращнных на жидких питательных средах

Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.

Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.

Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.

Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.

Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.

Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).

3. Мазок из гноя
Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.

Исследование мокроты

Приготовление мазка мокроты

Для приготовления окрашенных препаратов выбирают отдельные комочки и частицы мокроты и переносят прокаленной и остуженной лопаточкой или пинцетом на предметное стекло, которое покрывают другим предметным стеклом. Затем стекла раздвигают скольжением, снова накладывают их одно на другое и опять раздвигают; так поступают до тех пор, пока мокрота равномерно не покроет оба стекла тонким слоем. Если комочки очень плотны, их расщепляют предварительно прокаленными и остуженными препаровальными иглами. Приготовление препаратов требует известных навыков: нельзя брать слишком много мокроты, чтобы не получился толстый мазок, в котором трудно, а иногда и невозможно найти бактерии; кроме того, нужно следить за тем, чтобы мокрота была тщательно и равномерно размазана по стеклу.
Фиксация препарата. Препарат должен совершенно высохнуть на воздухе, иначе при дальнейшей обработке белок мокроты свернется. Сухие мазки фиксируют на пламени горелки, быстро проводя стеклышки 3—4 раза через огонь; при этом слой мокроты должен быть обращен кверху. Фиксировать нужно очень внимательно: если фиксация будет недостаточна, то при окраске мокрота смоется, а при передержке на огне мокрота обуглится и препарат будет испорчен.
Для нахождения в мокроте различных бактерий фиксированный препарат окрашивают различными красками.

Исследование мокроты на микобактерии туберкулеза

Окраска. Самым простым и наиболее распространенным способом окраски микобактерии туберкулеза является способ Циля — Нильсена. На предметное стекло с приготовленным и зафиксированным препаратом мокроты помещают полоску фильтровальной бумаги чуть меньше предметного стекла. Поверх бумаги наливают столько краски Циля (карболовый раствор фуксина), чтобы она не переливалась через край стекла. Затем стекло подогревают снизу на горелке до образования паров (но не до кипения!), после чего пинцетом снимают фильтровальную бумагу, смывают дистиллированной водой излишек краски и помещают препарат в 3°/о раствор солянокислого спирта, в котором держат до обесцвечивания. Затем препарат обмывают дистиллированной водой и в течение 1/2—1 минуты дополнительно окрашивают раствором метиленового синего. Затем остаток краски смывают дистиллированной водой и препарат высушивают.

Под микроскопом на синем фоне вырисовываются красные микобактерии, имеющие вид тонкой короткой палочки.

5. метод «раздавленной капли»
На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят кап исслед.материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля дб небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х

6.Посеять исследуемый материал на твердую питательную среду (МПА в чашки Петри) шпателем.
1)Приоткрыть крышку чашки Петри(среду можно разделить на 4 сектора)
2)Материал предварительно наносят на поверхность питательной среды возле края чашки петлей или пипеткой.
3)Стерильный шпатель проносят через пламя, охлаждают, касаясь стенки чашки. 4)Осторожными круговыми движениями, держа чашку полузакрытой, распределяют материал равномерно по поверхности среды.
5)Инкубируют

7. Приготовление мазков из крови
1)На чистое обезжиренное стекло ближе к одному из его концов поместить каплю крови. Другое предметное стекло со шлифованным краем прижать под углом 45 градусов к капле крови, а затем скользящим движением передвинуть его к другому концу нижнего стекла. При этом кровь распределится по предметному стеклу тонким слоем. Высушить препарат на воздухе, фиксировать в жидком фиксаторе (метиловый спирт или смесь этилового спирта и эфира)
2) Окрасить по мет Романовскому-Гимзы( смесь метил синего , эозина и азура) На мазок нанести рабочий раствор красителя(2 кап красителя на 1 мл Н2О на 10-20 мин). Затем препарат промыть Н2Ои высушить на воздухе.
Спирохеты возвратного тифа окраш в фиолет цвет, эритроциты крови-розовый,ядра лейкоцитов-в фиолетовый. Трепонемы окраш в бледно-розовый цвет, лептоспиры-в розово-сиреневатый

8. Пересеять культуру со скошенного агара на пит среду
1) Посев культуры в агаровый столбик (уколом) производят в плотную среду (МПА) при помощи бактериологической петли. Для этого прокаленной и остуженной петлей прикасаются к культуре микроба и вносят ее в пробирку с питательной средой. Посев производят уколом в столбик среды до дна пробирки.
2) При посеве культуры бактерий в жидкие питательные среды необходимо учесть следующее:не допускать, чтобы жидкая среда выливалась и смачивала пробку при полугоризонтальном положении пробирки.
!!!!!!!Посев из пробирки в пробирку.
1) посевы производят непосредственно около зажженной горелки, в пламени которой стерилизуют петли, пинцеты, ватные пробки, края пробирок;
2) в левую руку берут одну пробирку с пересеваемой культурой, другую (со стерильной питательной средой) держат в наклонном положении между большим и указательным пальцами;
3) петлю держат в вертикальном положении над пламенем горелки и прокаливают ее металлическую часть докрасна, дают чуть остыть ,а затем наклоняют горизонтально и стерилизуют держатель петли;
4) вынимают ватные пробки и держат их безымянным пальцем и мизинцем правой руки; класть пробки на стол или на какой-нибудь предмет не рекомендуется;
5) обжигают края обеих пробирок;
6) вносят петлю в пробирку с пересеваемой культурой осторожно, не касаясь стенок, захватывают каплю жидкости или небольшое количество налета на твердой среде и переносят, стараясь не задеть стенок, во вторую пробирку с обеспложенной питательной средой;

При посеве в жидкую среду посевной материал растирают на стенке пробирки над жидкостью и смывают средой.

9.Метод «висячей капли»
1)препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят 1 кап бакт.культуры
2) предм.стекло с лункой, края которого смазаны вазелином, прижимают к покровному стеклу , чтобы капля находилась в центре лунки
3) быстрым движением переворачиваем препарат покровным стеклом вверх
4)в правильном приготовлении капля должна свободно виесть над лункой , не касаясь ее дна или края.
Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под ув которого находят край капли, а зтем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат

10.Посеять кровь на жидкую питательную среду
Кровь засевается в жидкую питательную среду в соотношении не менее чем 1(кровь): 10(среда),с тем чтобы максимально уменьшить бактерицидную активность нормальной сыворотки, а также воздействие присутствующих в ней антимикробных агентов.

1.Набирают 5 мл крови в шприц.
2.Затем зажигает спиртовку.
3. В правую руку, как писчее перо, берет шприц с кровью, в левую - колбу с желчным бульоном. Мизинцем правой кисти прижимает пробку к гипотенору и открывает горло колбы над пламенем спиртовки, сливает медленно по стенке колбы 5 мл крови. Встряхнуть пробирку и в термостат.
4.Шприц откладывает в тазик.
5.Обжигает пробку и горло колбы и закрывает ее.
В таком же порядке производится посев крови на сахарный бульон.

11. посеять культуру микробов на среду Ресселя
Применятся пр изучении биохимических свойств энтеробактерий (шигелл, сальмонелл) Содержит пит.агар, лактозу, глюкозу и индикатор бромтимоловый синий
цвет приготовленной среды травянисто-зеленый
1)посев делают штрихом со скошенной поверхности и уколом в глубину столбика.Микроорганизмы , ферментир.глюкозу до кислоты, вызывают изменения окраски столбика среды из первоначальной трав.-зеленой в
желтую!; скошенная повер-ть при этом приобретает синий
2) Лактоз+ изменяют цвет столбика и скошенной части среды в желтый. Микроорганизмы, образ-е щелочь , изменяют цвет среды в синий.
Газообразование отмечается в толще столбика среды

12.Провести обеззараживание при попадании заразного материала на поверхность стола.
Дезинфицирующие вещества:
-хлорная известь(0,1-10% раствор)
-хлорамин(0,5-5% раствор)
-фенол или карболовая кислота(3-5% раствор)
-лизол(3-5% раствор)
-двутретьосновная соль гипохлорида кальция(ДТСГК 0,1-10 % раствор )
Выбор дезинфицирующего вещества и его концентрации зависит от материала, подлежащего дезинфекции.

13. Посев колоний с чашек Петри на скошенный агар
открывают чашку Петри по правилам:
одним пальцем, в полуоткрытом состоянии , прокалённой петлей берем 1 колонию(большую) , закрываем, берем пробирку со скошенным агаром, и ПО САМОЙ СРЕДЕ, СНИЗУ ВВЕРХ ДЕЛАЕМ ПОСЕВ ВОЛНООБРАЗНЫМ ДВИЖЕНИЕМ, К СТЕКЛУ НЕ ПРИКАСАТЬ!!!!Затем петлю прокалить.Указать дату на пробирке.Этот метод для выделения чистой культуры

14.Посеять гной на пит.среду

Возбудителями гнойно-воспалительных процессов дыхательных путей чаще всего являются условно-патогенные микроорганизмы следующих родов и видов: Streptococcuspneumoniae, Streptococcuspyogenes, Staphylococcusaureus, Haemophilusinfluenzae, Pseudomonasaeruginosa, Neisseria, Corynebacterium, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Candida, Actinomyces и др.

При направленном исследовании могут быть выделены Mycobacteriumtuberculosis и другие микобактерии, Mycoplasma, Bacteroides.

Особенностью микробиологического исследования при инфекциях дыхательных путей является почти обязательное наличие в исследуемом материале нескольких видов микроорганизмов.

В отделяемом зева, трахеи, бронхов, носа в норме обнаруживаются следующие микроорганизмы: Staphylococcusepidermidis, Streptococcusviridans, Neisseria, Corynebacterium, Lactobacillus, Candida и некоторые другие. При носительстве могут быть обнаружены S. aureus, S. pneumonia, S. pyogenes.

Мокрота, проходя через верхние дыхательные пути и полость рта, может контаминироваться вегетирующей в них микрофлорой.

Взятие исследуемого материала

Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1 - 2 часа.

Мокрота. Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.

Промывные воды бронхов. При отсутствии или скудном количестве мокроты производят смыв из бронхов физиологическим раствором, однако, при этом микробиологическая ценность исследования снижается из-за разведения секрета (часто значительного) и бактерицидного действия раствора на чувствительные микроорганизмы, поэтому нередко концентрация бактерий в бронхиальном содержимом в 10 - 1000 раз ниже, чем в мокроте. Кроме того, трудоемкость эндоскопического взятия материала и тяжесть манипуляции для больного ограничивает проведение повторных исследований в динамике заболевания.

При бронхоскопии рекомендуется вводить не более 5 мл физиологического раствора с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.

Пунктат инфильтрата или абсцесса легкого. Исследование пунктата наиболее эффективно до прорыва инфильтрата или абсцесса в дренирующий бронх. При трансторакальной пункции получают материал непосредственно из очага поражения и избегают его обсеменения посторонней микрофлорой.

Глотка, ротовая полость и нос. Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 часа после еды стерильным ватным тампоном или ложечкой со слизистой оболочки или ее пораженных участков у выходов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом.

Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном. Тампон осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до его окончания. Для проведения анализов на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки. Материал из носа и глотки берут разными тампонами. При подозрении на клебсиеллы, независимо от места локализации процесса, исследуют материал из носоглотки и обеих половин носовой полости.

Микроскопия исследуемого материала

Из мокроты или материала, взятого стерильным ватным тампоном, одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом.

При обнаружении микроорганизмов отмечают их морфологические и тинкториальные свойства (кокки, палочки, отношение к окраске по Граму).

Микроскопическое исследование является важным ориентиром. При просмотре мазков из мокроты оценивают общую картину микрофлоры: наличие скоплений грамположительных кокков (Staphylococcus, Micrococcus); цепочек грамположительных кокков (Streptococcus); мелких ланцетовидных, окруженных зоной неокрасившейся капсулы (S. pneumoniae); грамотрицательных кокков (Neisseria); грамотрицательных палочек с закругленными концами, окруженных капсулой в виде светлого ореола (Klebsiella и др.); грамотрицательных палочек (E. coli, P. aeruginosa и др.); мелких грамотрицательных палочек в виде скоплений (Haemophylus); мицелия в бластоспор гриба.

При исследовании мокроты обращают внимание на наличие гранулоцитов, которые всегда можно обнаружить при воспалительных процессах в нижних отделах дыхательного тракта. Их отсутствие и большое количество эпителиальных клеток в мокроте свидетельствует о том, что материал взят неправильно (с примесью слюны) и требуется его повторное взятие. При острой инфекции в мокроте, как правило, обнаруживают не более 1 - 2 типов бактерий, локализованных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы, попавшие из ротовой полости, чаще располагаются около эпителиальных клеток, и ими следует пренебречь.

По результатам микроскопии могут быть внесены изменения в ход микробиологического исследования.

Посев исследуемого материала

Питательные среды.

Основная питательная среда: 5% кровяной агар

Могут быть использованы дополнительные питательные среды:

Среда ВНИИП: агар-агар, 2 г; гидролизатХоттингера или казеина (1,8 - 2,0 г/л аминного азота), 75 мл; гидролизат бычьих сердец (1,4 - 1,8 г/л аминного азота), 25 мл; экстракт пекарских дрожжей, 0,5 г. К среде добавляют дефибринированную кровь лошади, барана, кролика, 5 мл.

Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 720; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!