Техника получения первично-трипсинизированнной культуры клеток
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
|
Факультет Биотехнологий и Ветеринарной медицины
КафедраИБЗиВСЭ
Специальность Ветеринария
Форма обучения очная
Курс II
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА ОБУЧАЮЩЕГОСЯ
ДисциплинаВЕТЕРИНАРНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯАнатомия животных
Модуль 1 «Общая вирусология»
Студент Фазылова МавлудабонуИзатуллоевна
Руководитель:
Кбн,доцент
Николаева Оксана Николаевна
(ученая степень, звание, Ф.И.О)
Оценка при защите:
____________________________
____________________________
(подпись)
«____»_________________ 20__г.
Уфа 2017
Оглавление
1.Применение бактериофагов для терапии и профилактики инфекционных болезней……………………………………………………………………….….3
2.Техника получения первично-трипсинизированнной культуры клеток…..11
2.1 Получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожно-мышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов…………………..….13
2.2 Клетки подсчитывают в камере Горяева…………………………………14
Применение бактериофагов для терапии и профилактики инфекционных болезней
Бактериофаги (фаг, от греч. phagos – пожирающий) – группа вирусов, паразитирующих на бактериях.(Приложение А) Бактериофаги широко распространены в природе и обнаруживаются в воде, почве, сточных водах, организме человека и животных, а также в культурах бактерий. Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, строению фаговой частицы, морфологии негативных колоний, характеру взаимодействия с микробной клеткой.[1]
|
|
|
Первыми были выделены бактериофаги, активные против патогенных микроорганизмов (дизентерийной палочки). (Приложение Б) Вполне естественно, что у исследователей многих стран возник вопрос об использовании фагов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями (дизентерия, брюшной тиф, паратифы, холера и др.). Многочисленные исследования в этой области были проведены и в РФ. Результаты этих работ весьма разноречивы. Имеются данные, показывающие несомненную эффективность фагов при лечении дизентерии и холеры. Во время Великой Отечественной войны некоторые хирурги успешно применяли фаги для борьбы с нагноением ран. «Сталинский антибиотик»-старое лекарство из красноармейского вещмешка может вернуться во врачебную практику. В 30-х годах туберкулез и воспаление легких стали излечимыми, а гангрена перестала непременно заканчиваться ампутацией. Но врачи и фармацевты жарко спорили о том, какое антибактериальное средство эффективнее — антибиотики или бактериофаги.Главным преимуществом пенициллина и его производных была возможность изготавливать их синтетическим путем. Изобретение Александра Флеминга тогда одержало победу. Массовая эйфория по поводу бактериофагов сменилась забвением.Везде, кроме Советского Союза, где на родине Сталина, в Грузии, специальный медицинский институт продолжал соответствующие исследования. В результате родились противовоспалительные препараты, который широко использовались при самых разных диагнозах — от заражения крови до простуды. Больше всего их применяли в Красной Армии, но они использовались и в гражданской медицине, как в СССР, так и в некоторых странах Восточной Европы.До недавних пор использование бактериофагов считалось местной спецификой, если не признаком отсталости. Однако мировая медицина связанная с антибиотиками начала подходить к концу по мере того, как микробы стали приобретать к ним устойчивость.Чтобы создать новый сильнодействующий антибиотик, фармацевтические компании сегодня должны в среднем потратить 10 лет и 800 млн. долларов.[5]
|
|
|
Привлекательность антибиотиков, помимо всего прочего, состоит и в том, что одно и то же лекарство способно уничтожать разные бактерии. В случае с бактериофагами надо вывести отдельный вирус для каждого инфекционного заболевания. Правда, бактерии могут приобрести устойчивость к отдельным фагам, как они уже научились сопротивляться антибиотикам. В этом случае придется создавать новые разновидности вирусов. Скорее всего, чтобы повысить эффективность лечения, будут использоваться «коктейли» из нескольких фагов.Лечение бактериофагами не дает побочных эффектов. Правда, известно, что в 30-е и 40-е годы оно довольно часто не давало вовсе никакого эффекта, и пациенты умирали.Однако современные энтузиасты «нового старого» метода терапии убеждены, что дело не в его недостатках как такового, а в несовершенстве технологий более чем полувековой давности и неправильных диагнозах.
|
|
|
Самый большой сектор - это бактерии нормофлоры, которые создают с организмом взаимовыгодное сосуществование. Человек для них является средой обитания, а бактерии участвуют во многих жизненно важных для организма процессах, связанных в первую очередь с обменом веществ.
Следующий по величине сектор - медиаторы - вещества, которые выделяют сами клетки кожи и все виды микроорганизмов. Это могут быть сигнальные белковые молекулы, лизоцим, витамины, молочная кислота, другие органические кислоты и т.д. Медиаторы являются одним из самых важных звеньев в существовании микробиоценоза и регулируют многие связи в организме. Еще пять небольших секторов занимают грибы, вирусы, бактериофаги, простейшие и болезнетворные бактерии, типа стрептококков и стафилококков. При изменении этого соотношения или при исчезновении одного из "секторов" под воздействием неблагоприятных факторов возникают воспалительные процессы.[5]
|
|
|
Взаимодействие с некоторыми бактериями является крайне опасным (например, с палочкой чумного микроба, хотя летальный исход может наступить и от заражения крови обыкновенным стрептококком). В то же время без присутствия лактобактерий или бифидобактерий нарушаются многие функции слизистых оболочек и возникают заболевания. Эти бактерии находятся в симбиозе с организмом, а бактерии чумы - являются паразитами. Биологический термин "паразит" означает, что один живой организм живет и размножается за счет другого. Вид, в котором этот организм паразитируетназывается, хозяином. Очень часто в природе такое взаимодействие заканчивается гибелью хозяина и увеличением численности паразита. Численность паразита в свою очередь ограничивает другой вид, для которого паразит является хозяином. Таким образом, паразит - биологический ограничитель. Именно существование биологических ограничителей обеспечивает гармонию в живой природе и сохранение всех биологических видов.[7]
Биологическими ограничителями бактерий являются бактериофаги, в свою очередь,биологическими ограничителями фагов являются медиаторы выделяемые клетками кожи ,бактериями и грибами. Фаги, бактерии, грибы, простейшие, даже мелкие насекомые, типа клещей, могут быть легко обнаружены и уничтожены целой системой клеток кожи, тем не менее, этого не происходит. В здоровом состоянии все находится в гармонии, "все уживаются" друг с другом, а вот при нарушении этих взаимоотношений возникают проблемы, и приходится восстанавливать утраченное.[3]
Таким образом, исчезновение бактериофагов из этой цепочки создаст условия для размножения болезнетворных бактерий, следовательно можно рассматривать фаги как один из методов, созданных самой природой для поддержания микробиоценоза организма человека или животных.
Бактериофагов используют:
1.Для идентификации микроорганизмов, в том числе и для диагностики инфекционных заболеваний (в фагодиагностике – методе косвенной диагностики инфекционных заболеваний, заключающемся в выделении специфического фага из организма больного).
2.Для выявления бактериального загрязнения (в фагоиндикации,когда присутствие фага рассматривают как косвенный показатель загрязненности исследуемого материала).
3.Для профилактики некоторых инфекционных заболеваний (в фагопрофилактике – методе предупреждения некоторых кишечных инфекционных заболеваний (бактериальной дизентерии, холеры, сальмонеллеза и др.) с помощью препаратов бактериофагов).
4.Для лечения некоторых инфекционных болезней (в фаготерапии – методе лечения некоторых инфекций с помощью препаратов бактериофагов).[1]
Фагодиагностику бактерий осуществляют путем постановки пробы на фаголизис в жидкой или плотной питательной среде. Методы фагодиагностики используют главным образом при работе с возбудителями кишечных и особо опасных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезов, холеры, сибирской язвы, бруцеллеза). Колифаги(Приложение В) являются адекватными индикаторами загрязнения воды коли-бактериями, на которых они паразитируют, а также другими кишечными вирусами, поскольку и колифаги и кишечные вирусы имеютобщий источник поступления в окружающую среду. Показатель наличия колифагов можно использовать для оценки эффективности процессов очистки воды от вирусного загрязнения. С 1999 г. новый СанПиН РБ по качеству питьевой воды регламентирует ее контроль на присутствие колифагов, в случае обнаружения которых проводятся исследования воды на энтеровирусы.[1]
В хирургии фаги стали применять с 1921 г. и отмечали их эффективность при раннем введении, с редкими побочными реакциями. Помимо орального введения фаги наносили на место поражения, применяли в аэрозолях. Но затем из-за успешного применения антибиотиков, особенно при тяжелых осложнениях, бактериофаги стали использоваться все реже и реже. С 1980–1990 гг. XX в. интерес к бактериофагам начал возрождаться в результате широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов. Развитие резистентности к антибиотикам госпитальных штаммов микроорганизмов значительно опережает создание новых препаратов, которое требует вложения громадных средств и длительного времени. В хирургических стационарах и трансплантологических клиниках эта проблема приобретает наиболее острое значение как из-за многочисленных инвазивных манипуляций и устройств, тяжелых высокотехнологичных операций, так и из-за контингента пациентов с иммунодефицитными состояниями.[1]
Бактериофаги широко применялись для лечения различных заболеваний с 20-х гг. ХХ в. во многих странах мира. В России и странах СНГ препараты бактриофагов производятся с 40-х гг. и применяют для профилактики и лечения:
– инфекционных поражений желудочно-кишечного тракта (дизентерия, брюшной тиф, сальмонеллез, дисбактериоз);
– гнойно-воспалительных заболеваний глаз, ушей, носа, ротовой полости, горла, легких (отит, ангина, фарингит, стоматит, пародонтит, конъюнктивит, гайморит, пневмония);
– хирургических инфекций (обработка послеоперационных и гноящихся ран, гнойные поражения кожи, перитонит);
– ожоговых ран;
– урогенитальных инфекций (цистит, пиелонефрит, вульвит).
Препараты бактериофагов выпускают в виде таблеток, мазей, аэрозолей, свечей и суспензий. Традиционной формой выпуска является жидкий препарат. Употребляют препараты для орошения полостей, смазывания раневых поверхностей, вводя перорально, внутривенно и т.п. Широкое применение нашли следующие лечебно-профилактические культуры бактериофагов: стафилококковый, стрептококковый, дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный, колифаг, протейный, синегнойный; для снижения частоты бактериальных осложнений у больных используется также пиобактериофаг; имеются комбинированные препараты, используемые при кишечных инфекциях, инфекциях стрептококковой и стафилококковой этиологии, ожогах и травмах, осложненных гнойным воспалением и др. [1]
Для лечения заболеваний вирусно-бактериальной этиологии создан комплексный биологический препарат «Интерфаг», содержащий интерферон и бактериофаги. Препараты бактериофагов используются в клинической практике наряду с антибиотиками. Известно, что во многих случаях фаговые препараты превосходят другие антибактериальные препараты по активностив отношении антибиотикорезистентных возбудителей. Бактериофаги не вызывают побочных токсических и аллергических реакций и не имеют противопоказаний.[1]
Использование препаратов бактериофагов стимулирует активизацию факторов специфического и неспецифического иммунитета, поэтому фаготерапия особенно эффективна при лечении хронических воспалительныхзаболеваний на фоне иммунодепрессивных состояний. Бактериофаги не препятствуют реализации лечебного действия других препаратов (антибиотики, пробиотики, синбиотики) и не чувствительны к их воздействию.Показательны в своей эффективности результаты сочетания фаготерапиии антибиотикотерапии при ассоциированных инфекциях, вызванных полирезистентными штаммами Pseudomonasaeruginosa и Staphylococcusaureus.[1]
Таким образом, препараты бактериофагов выгодно отличаются от антибиотиков по ряду существенных свойств:
– бактериофаги высоко специфичны при лечении инфекций, не подавляют нормальную микрофлору и не нарушают естественный баланс внутренней среды организма, т. е. фаготерапия является специфической;
– бактериофаги не имеют противопоказаний к применению: их можно назначать беременным, кормящим матерям и детям любого возраста,включая недоношенных;
– бактериофаги могут использоваться не только для лечения, но и для профилактики бактериальных инфекций;
– бактериофаги не вызывают развития резистентности у микроорганизмов;
– бактериофаги оказывают стимулирующее влияние на гуморальное и клеточное звенья иммунитета;
– бактериофаги не обладают токсическим, аллергическим и тератогенным эффектами, что особенно важно для лиц с аллергией к антибиотикам.
– бактериофаги эффективны в монотерапии, но также могут применяться в комбинации с другими препаратами, в т.ч. с антибиотиками и пробиотиками.
Несмотря на то, что фаготерапия имеет достаточно высокую клиническую эффективность при лечении больных с бактериальными инфекциями (80–95 %), особенно вызванными антибиотико-резистентными штаммами микроорганизмов, она длительный период времени не получала широкого применения в международной клинической практике. Возрождение интереса к бактериофагам и фаготерапевтическим мероприятиям наблюдается в 2000-е годы последнего десятилетия в разныхстранах мира, что связано с возникновением множественной лекарственной устойчивости бактериальных штаммов вследствии многолетнего применения антибиотиков для лечения различных заболеваний. В 2009 году в Стокгольме на конференции «Инновационные задачи в области эффективности антибактериальных препаратов» и в Москве, в рамках круглогостола «Эра антибиотиков заканчивается: альтернативные возможности в антибактериальной терапии» приведены неоспоримые факты о последствиях антибиотикотерапии:
– от инфекций, вызванных бактериями, имеющими множественную лекарственную устойчивость, умирает ежегодно более 25 000 пациентов(только в странах ЕС);
– возникновение антибиотикорезистентных форм микроорганизмов влечет невосполнимый ущерб экономике развитых стран;
– разработка нового препарата антибиотика, его клинические испытания и регистрация требуют значительных капиталовложений и занимаютдолгие годы.
Бактериофаги, открытые в прошлом веке, призваны создать достойную альтернативу антибиотикам в терапии множества заболеваний бактериального происхождения, обладая следующими преимуществами:
-бактериофаги самостоятельно контролируют свое воспроизведение, размножаясь только при наличии чувствительной культуры;
-бактериофаги обладают гораздо более высокой специфичностью, чем антибиотики, что приводит к наименьшему повреждению нормальной микрофлоры организма и, следовательно, к снижению риска заболевания вторичными микробными инфекциями, сопровождающими дисбактериозы;
-бактериофаги могут снижать вирулентность даже резистентных к ним штаммов за счет использования в качестве мишени для адсорбциирецепторов, участвующих в патогенезе бактерии;
-отсутствие выраженных побочных эффектов при фаготерапии;
-фаготерапия может применяться к беременным и кормящим женщинам, младенцам, у лиц с аллергией к антибиотикам;
-бактериофаги можно использовать в профилактических целях предотвращение инфицирования при контакте с микробами, санация медицинских учреждений, борьба с внутрибольничными инфекциями.
-препараты на основе бактериофагов просты в производстве, которое может быть налажено локально и удовлетворять потребностям конкретной местности;
-фаговые препараты можно использовать в сочетании с антибиотиками, что уменьшает вероятность развития резистентности бактерий;
-препараты местного применения на основе бактериофагов способны проникать глубоко в ткани и размножаться в месте локализации инфекции.[1]
Техника получения первично-трипсинизированнной культуры клеток
В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:
- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.
- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.
- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на:
1) первичные (первично трипсинизированные),
2) полуперевиваемые (диплоидные)
3) перевиваемые.
По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.[7]
Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.[7]
Полуперевиваемые (или диплоидные) культуры клеток - клетки одного типа, способные invitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.[7]
Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению invitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит invivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.
Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования.[7]
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 365; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!