Основы метода ренатурации ДНК
начало 60-х, Шпигельман
ДНК обр. ультразвуком, она порубится на 2-х цеп. куски. Далее – тепловая денатурация и медл. охлаждение (на 20º ниже Т плав.). Происходит ренатурация – 100% недостижима.
После этого можно отделить 1-цеп. куски от 2-цеп. и оценить скорость ренатурации. Более многочисленные ренат. быстрее.
1. Бимолкул. стадия. (уч. 2 мол-лы). Скорость этой стадии пропорциональна квадрату концентрации одноцеп. ДНК.
2. Монокул. стадия – замыкание, пропорциональна конц. одноцеп.ДНК
Процесс ренатурации: dC/dT=kC2, k – конст. скорости.
С=С0 при t=0, C/C0=1/(1+ kC0t). Если C0t=1/k, то С/С0=1/2 – полуреакция. С0t1/2 – кот, критерий оценки любой посл. ДНК.
По котам можно разбить ДНК на 3 грубые фракции:
1. Быстрые повторы: кот<10-2c. Частота встречаемости в геноме больше 105
2. Умеренные повторы 10-2< кот<103, частота встреч. от 10 до 105
3. Уникальные последовательности кот>103, частота встречаемости менее 10 раз
Есть ещё палиндромы. Ренатурируют мгновенно, а встречаемость может быть низка.
Вопрос 79
Сателлитная ДНК. Состав. Ловализация в геноме. Возможная роль.
Относится к быстрым повторам.
Денатур. ДНК в начале 60-х центрифугировали в градиенте плотности.
Сателлиты – отсутствие одного из нуклеотидов в цепи (некодир, никогда не транслируется – в конститут. г/хр). Большая плотность, много пуринов.
Сат.ДНК обязательно в центром. районе, равномерно по плечам; максимально компактизованы, все 4 ур-ня даже в интерфазной хром.
По сател. ДНК происходит кроссинговер гомолог. хромосом.
Всегда располагается тандемно в блоке по 100-200 ед. Образуют длинные посл. в геноме
У недавно обр. на одной терр. близких видов сат.ДНК заведомо разная – обеспечивает бесплодие межвид. гибридов
Вопрос 80
Гены домашнего хозяйства. Гены роскоши.
Гены д.х. кодируют то, что всегда нужно в любой клетке независимо от ткани. Их 10-20 тыс. Это гистоновые гены, гены тРНК, sРНК, нек. rРНК и т.д.
Генов роскоши больше в 2-3 раза, они экспрессируются в опр. время в опред. клетках.
Вопрос 81
Нестабильность генома. Класс. мобильных Эл-тов.
Начало 40-х, Барбара Маклинтер, США – пятнистость у кукурузы (отдельные чёрные зёрна или части).
Нельзя объяснить через законы Менделя – идея моб. ген Эл-тов – нуклеотидных последовательностей, меняющих место в геноме. Нобелевка в 1983
Мобильные эл-ты прокариот
В основном IS (встав. посл-ти) и Тn (транспозоны).
IS – эгоистичные Эл-ты, в них закодирован 1 белок – транспозаза, размер 1000 нук. НА концах обязательно инверт. повторы (20 п.н.)
Транспозаза вырезает IS с обр. липких концов и встраивает в др. место в мол-ле ДНК.
Перед геном IS им. промотр, за геном – слабый терминатор. Не всегда РНК-полим. ост. на нём, может идти дальше до сильного терминатора.
Плазмиды – короткие (1-3 тыс) мол-лы ДНК с ori-репликац. Мультипликация Эл-та за счёт репликации плазмид – перемещение м/ду бак. (разных видов тоже). При встраивании меняет активность оперона. При инверт. встраивании – обратносмысл. РНК блокирует синтез смысловой.
Tn по строению непринц., по ф-ям принц. отл. от IS. несут кроме гена транспозазы ещё 1-2 гена лекарст. уст. (инактивация антибиотиков). Не полностью эгоистичен – лек. уст. передаётся м/ду бак. Размер 3-10 тыс. нук. устроены как IS, есть прямые повторы , long terminal repeats. Небольшая доза антиб. выраб. лек. уст.
Некоторые Умеренные фаги – тоже м.э
Мобильные Эл-ты эукарот
(контрольные Эл-ты кукурузы)
sine – короткие Эл-ты (10% генома)
line – длинные Эл-ты (20% генома)
Доля интронов в белковых генах – 20%, 12% - уникальные регулят. послед.
Все цифры – для человека.
У E.coli 88% - белоккодир, 1% - гены тРНК и рРНК, 11% - некодир. (промоторы, операторы, терминаторы). Единств. повтор – гены рРНК
sine – 100-500 п.н., некодир, есть А и В боксы, узнав. базальными т/ф pol III – бывшие гены рРНК и испорч. гены 7sРНК (входит в комплекс, прервод. секрет. белки через ретикулюм)
Кол-во копий sine – до 100 тыс
Al4 повторы (есть сайт для рестрикции Al4). Обычно фланкируют гены человека и иногда в интронах
line – щт 6 тыс и более – есть до 2-х 3-х откр. рамок считывания
off1 – ф-ия неизвестна
off2 – код. белок-гоиолог обр. транскриптазы.
Line-эл-ты – из провирусов. Их внедрение иногда вызывает болезни.
Line 1 – от 50 до 100 повторов (5% генома, 6500 п.н.), полноценный ген обр. транскр. Из них только 3 тыс. копий с полной длинной – для полноц. обр. транскр. Малая часть экспрессируется (больш. сод. мутации по этому гену)
Если line1 встраивается в ген фак-ра свёрт, в X хром. – гемофилия. У приматов пост. локализация – 21-я хром.
Эффекты, вызываемые мобильными элементами
- Внедрение мобильных элементов внутрь гена приводит к выключению гена.
- Может нарушаться регуляция гена, если мобильный элемент внедряется между оператором и цистроном (у мобильного элемента есть свой промотор).
- Вставка мобильного элемента может привести к экспрессии генов, которые не должны в данное время работать.
Наличие мобильных элементов является фактором, способствующим незаконной рекомбинации.
При незаконной рекомбинации перетасовываются гены, не имеющие отношения друг к другу.
Мобильные элементы провоцируют образование делеций, инверсий, дупликаций. Все это - хромосомные мутации.
Вопрос 83
Некоторые вирусы - на самом деле тоже мобильные элементы. В форме провируса они находятся в геноме клетки хозяина, а потом могут начать перемещаться. Это, например, онкорнавирусы, являющиеся ретровирусами.
Обратная транскрипция
Определение: обратная транскрипция - это синтез ДНК по матрице РНК.
Обратную транскрипцию обнаружили в 1970 г. Темин, Балтимор, Дульбеко, работавшие с вирусом саркомы Рауса (ВСР). Этот вирус вызывает саркому у кур. Это онкорнавирус (oncoRNA) - относится к ретровирусам.
Определение: ретровирусы - это РНК-содержащие вирусы, в жизненный цикл которых входит стадия образования ДНК обратной транскриптазой и внедрение ее в геном клетки хозяина в форме провируса.
Предпочтительного места внедрения провируса в геном нет. Это позволяет отнести его к мобильным генетическим элементам.
В состав ретровируса входит две идентичные молекулы РНК. На 5'-конце имеется Сap, на 3'-конце - поли А-хвост. Фермент обратную транскриптазу вирус "носит" c собой.
Геном ретровируса содержит 4 гена:
gag - белок нуклеоида,
pol - обратная транскриптаза,
env - белок капсида (оболочки),
onc - онкоген, ответственный за злокачественную трансформацию клетки.
str5 = str3 - (short terminal repeat) короткий концевой повтор;
U5, U3 - уникальные последовательности (U5 - 80 н., U3 - 200 н.);
PB (primer binding site) - участок связывания затравки.
На РВ садится (за счет комплементарности) tРНК и служит затравкой для синтеза ДНК.
Синтезируется небольшой кусок ДНК.
Обратная транскриптаза, обладая еще и активностью РНК-азы Н, удаляет РНК в гибриде с ДНК, а за счет идентичности str3 и str5 этот одноцепочечный участок ДНК взаимодействует с 3'-концом второй молекулы РНК, которая служит матрицей для продолжения синтеза цепи ДНК.
Затем РНК-матрица уничтожается и по образовавшейся цепи ДНК строится комплементарная.
Образованная молекула ДНК длиннее РНК. Она содержит LTR (U3 str 3(5) U5). В форме провируса она находится в геноме клетки хозяина. При митозе и мейозе передается дочерним клеткам и потомкам.
Большинство изученных вирусных онкогенов кодируют протеинкиназу, фермент, который фосфорилирует белки. Как правило - это тирозиновая протеинкиназа. В клетке есть собственные протеинкиназы, в том числе и тирозиновая, но гораздо более активны сериновая и треониновая. Гены, кодирующие клеточные протеинкиназы, обозначают oncc, вирусные - oncv. Oncc - клеточные гены, работающие в дифференцированных клетках. Oncc имеют интроны, oncv - не имеют. Oncv либо добавляет тирозиновую протеинкиназу - и сказывается дозовый эффект гена тирозиновой протеинкиназы, либо, по сравнению с клеткой, не имеющей oncv, клетка, его имеющая, фосфорилирует тирозин, а не серин или треонин, как обычно, то есть происходит смена мишени.
В первую очередь это касается белков, присутствующих в клетке в большом количестве. Это белки цитоскелета (нарушение адгезии), мембранные белки (нарушение контактного торможения), гистоны (нарушение регуляции, компактизации, облегчение репликации ДНК).
Ретровирусы скорее всего возникли в результате внедрения мобильных элементов в непосредственной близости от oncc генов. В дальнейшем oncc превратился в oncv, а клеточная полимераза - в обратную транскриптазу. Вирус начал самостоятельную жизнь. Стадия провируса говорит о его клеточном происхождении.
Вопрос 83
Дата добавления: 2018-08-06; просмотров: 576; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!