Методы видового определения паразитов.

СОГЛАСОВАНО Директор Государственного учреждения «Белорусский государственный ветеринарный центр» _____________ Ю.А.Пивоварчик 01-06/1502 от 15.10.2007 г. УТВЕРЖДАЮ Начальник Главного управления ветеринарии с Государственной ветеринарной и Государственной продовольственной инспекциями Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь __________________А.М.Аксёнов 10-1-5/944 от 16.10. 2007 г. СОГЛАСОВАНО Директор Республиканского научно-исследовательского унитарного предприятия «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси ___________________ А.А. Гусев 14.10.2007 г.

Методические указания

по паразитологическому исследованию рыб.

Минск 2007г.

1.Общие положения.

1.1. При подозрении на заболевание инвазионной природы проводят полное паразитологическое исследование рыб. Для исследования используют живых или свежеснулых рыб всех возрастных групп из каждого водоёма в следующих количествах: личинок и мальков не менее 25 экземпляров, сеголетков 15 – 25, годовиков 10 – 15, рыб остальных возрастных групп 5 – 10 экземпляров. Результаты исследования вносят в рабочий журнал, где указывают дату, место вылова рыбы, пол, возраст, вес и длину рыбы, наличие паразитов с указанием вида и количества.

2. Порядок исследования.

2.1. Исследования проводят в следующем порядке: визуально осматривают поверхность тела, плавники, ротовая полость, жабры, глаза, кровь, сердце, брюшная полость, печень, селезёнка, плавательный пузырь, мочевой пузырь, почки, половые органы, кишечник, мышцы, головной и спиной мозг.

2.2. Для обнаружения кровепаразитов у рыб берут кровь из сердца и делают мазки.

3. Исследование внешних покровов.

3.1. При наружном осмотре кожного покрова и плавников собирают, предварительно определяют вид и фиксируют для последующего изучения всех паразитов визуально выявляемых: гельминты, ракообразные, пиявки, моллюски и др. После этого приступают к микроскопированию: - обнаружению мелких форм паразитов в мазках из соскобов с поверхности тела (мальки, сеголетки, годовики) или из некоторых участков тела (крупные рыбы). Скальпелем соскабливают слизь с кожного покрова и плавников, помещают её на покровное стекло и смешивают с нанесением ранее 2 – 3 каплями прокипячёной воды. Накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала под лупой, а потом под малым увеличении микроскопа. Исследование рыб на наличие возбудителей ихтиободоза (костиоза) ведут при сильном увеличении микроскопа. Кроме возбудителей ихтиободоза, на коже рыб паразитируют другие жгутиконосцы, а также инфузории, моногенетические сосальщики, пиявки, паразитические рачки, споровики.

3.2. Подсчёт количества крупных паразитов (рачков, гельминтов) проводят в абсолютных числах, а мелких (споровиков, инфузорий и других простейших) – в относительных, то есть подсчитывают количество паразитов в десяти полях зрения микроскопа и определяют среднее их количество в одном поле зрения. При этом отмечают экстенсивность и интенсивность инвазии по каждому виду паразита в отдельности для отдельного вида и возраста рыб.

3.3. При осмотре кожного покрова необходимо учитывать, что паразиты могут локализоваться в толще кожи (метацеркарии Posthodiplostomum cuticola) и даже в толще чешуи (метацеркарии Metagonimus yokogawai).

4. Исследование жабр.

4.1. Все жаберные дуги вынимают, помещают на предметное стекло, собирают всех видимых паразитов, подсчитывают и фиксируют. Соскоб с жаберных лепестков или целые жаберные дуги (сеголетков) с несколькими каплями воды зажимают между двумя предметными стёклами до прозрачности и исследуют при малом увеличении микроскопа.

4.2. Споровики, некоторые инфузории и личинки сосальщиков могут находиться не на поверхности жаберных лепестков, а в особых соединительнотканных образованиях (бугорках); обнаружить и извлечь их можно только после разрыва стенки бугорка с помощью препаровальных игл. В кровеносных сосудах жабр могут находиться яй ца сангвиникол, споры и мицелий грибка.

5. Исследование глаз.

Для обнаружения паразитов глаз существует два метода их исследования.

5.1. Первый метод. Глаза извлекают из глазных впадин, помещают на предметное стекло и вскрывают острыми ножницами с внутренней каудальной стороны. Извлеченное стекловидное тело, хрусталик и содержимое передней камеры глаза компрессируют двумя предметными стёклами и просматривают при малом увеличении микроскопа. В глазах можно обнаружить личинок сосальщиков и круглых червей.

5.2. Второй метод. Глаза из глазных впадин не извлекают, а острыми концами кривых глазных ножниц прокалывают склеру глаза в центре и надрезают до края глаза с обеих сторон так, чтобы получился горизонтальный разрез. На оба края разреза накладывают ножницы с полуоткрытыми браншами и слегка надавливают. Под давлением хрусталик глаза выходит на поверхность разреза вместе со стекловидным телом. Его подхватывают сведенными браншами ножниц и переносят на стекло. Исследуют так же, как описано в первом методе.

6. Исследование брюшной полости. Проводят дугообразный разрез от анального отверстия, к основанию левого грудного плавника , вводя непосредственно в него тупой конец одной из бранш ножниц. Вскрытую брюшную полость осматривают на наличие крупных паразитов (лигула, филометра, амфилина) , которые извлекают, а имеющиеся на серозных покровах и брыжейке бугорки исследуют под микроскопом.

6.1. Сердце. Для исследования сердце помещают в бактериологическую чашку с физиологическим раствором, вскрывают его полости, промывают образовавшийся осадок и исследуют под микроскопом на наличие возбудителя сангвиниколлёза и некоторых метацеркарий. На стенках сердца можно обнаружить цисты метацеркарий трематод рода Tetracotyle.

6.2. Печень. При наружном осмотре печени можно обнаружить на её поверхности личинок круглых червей и белые бугорки с заключёнными в них личинками ленточных червей. Чтобы обнаружить паразитов, обитающих внутри печени, её делят на небольшие кусочки, которые рассматривают в компрессирии и под лупой,а затем при слабом увеличении микроскопа.

6.3. Желчный пузырь. Желчный пузырь вырезают, помещают на предметное стекло, разрезают ножницами, делают соскоб с внутренней оболочки стенки пузыря. Соскоб и сам желчный пузырь помещают между двумя предметными стёклами и исследуют под лупой и микроскопом. В желчном пузыре можно обнаружить простейших, сосальщиков и личинок ленточных червей.

6.4. Селезёнка. Помещают между двумя предметными стёклами, сжимают до прозрачности и исследуют под микроскопом.

6.5. Почки. Для обнаружения паразитов почки помещают в компрессорий и исследуют под микроскопом. В почках можно найти крупных паразитов, споровиков и яица сосальщиков.

6.6. Плавательный пузырь. Наружную волокнистую оболочку плавательного пузыря снимают. Паразиты, находящиеся в стенке плавательного пузыря и его полостях, обычно хорошо видны, их извлекают и исследуют с помощью микроскопа. Для обнаружения самцов Philometroides lusiana соскоб с внутренней оболочки плавательного пузыря можно микроскопировать используя компрессорий.

6.7. Мочевой пузырь. Методика исследования сходна с исследованием желчного пузыря. В мочевом пузыре можно обнаружить сосальщиков, споровиков, инфузорий.

6.8. Половые органы. Для обнаружения паразитов икру или молоки исследуют по частям с помощью компрессория и стекол просматривают под микроскопом. В половых органах встречаются микроспоридии и крупные плероцеркоиды, окружённые фиброматозными сумками и свободно перемещающиеся между икринками.

6.9. Желудочно-кишечный тракт. Пищевод, желудок и кишечник извлекают, освобождают от жира и печени, расправляют и вскрывают ножницами, начиная с пищевода. По ходу вскрытия обнаруженных крупных паразитов (ленточных и круглых червей, сосальщиков) извлекают и помещают в физиологический раствор. Содержимое из различных отделов желудочно-кишечного тракта исследуют под микроскопом. Затем скальпелем из нескольких мест кишечника ,используя компрессорий, делают глубокий соскоб со слизистой оболочки и исследуют на наличие паразитов (кокцидии и др.) с помощью микроскопа..

7. Исследование мышц. Для обнаружения заражённости рыб плероцеркоидами лентецов и другими крупными паразитами мышцы разрезают на тонкие пластинки толщиной 5 мм и исследуют визуально. Чтобы обнаружить мелких паразитов, берут небольшие кусочки мышц из различных частей тела и помещают в компрессорий. Исследуют под контролем лупы и микроскопа с малым увеличением.

8. Исследование головного и спинного мозга. Исследуют с помощью компрессория. В этих органах можно обнаружить споровиков, личинок сосальщиков.

9. Исследование хрящей. Для обнаружения возбудителя миксозомоза (вертежа лососевых) исследуют черепные и межпозвоночные хрящи используя компрессорий..

Методы видового определения паразитов.

10.1. Для этого обычно готовят временные препараты, помещая объект в каплю воды на предметном стекле и покрыв его предметным стеклом.

10.2. Определение фиксированных паразитов. В случае затруднения видового определения тех или иных живых паразитов их необходимо консервировать в соответствующих жидкостях или приготовить из них постоянные препараты, этикетировать и сохранить для дальнейшей камеральной обработки специализированными лабораториями.

11. Методы фиксации и окраски.

11.1. Приготовление мазков крови для исследования на наличие кровепаразитов. Наносят каплю крови на край предметного стекла. Устанавливают вблизи от капли под углом 35 – 45⁰ шлифовальное стекло. Осторожно соприкасают его с каплей крови. Когда капля равномерно распределится около нижнего ребра шлифовального стекла, его плавно и относительно быстро передвигают по предметному стеклу.

Фиксация мазка.

Приготовленные мазки необходимо быстро высушить на воздухе, в термостатах, над пламенем спиртовки. Самым надёжным способом фиксации является использование метилового спирта, в котором мазок выдерживают в течение 3 – 5 минут. Можно использовать также этиловый спирт (20 – 30 мин), или этиловый спирт с эфиром в равных частях (5 – 10 мин). По окончании фиксации мазки высушивают на воздухе и окрашивают. Если краска приготовлена на фиксирующей основе (метиловый спирте), то предварительная фиксация не обязательна.

11.3. Окраска мазка. Готовую, имеющуюся в продаже краску Романовского - Гимза, перед окрашиванием разводят из расчёта 2 – 3 капли на 1 мл нейтральной дистиллированной воды. Если готовая краска отсутствует, её можно приготовить самим: 1 г азура II растворяют в 1 л прокипячёной дистиллированной воды (раствор №1) и 1 г эозина в 1 л воды (раствор №2); оба раствора хранят раздельно. Перед употреблением к 1 мл нейтральной дистиллированной воды прибавляют по 2 капли каждого раствора. Рабочий раствор краски наслаивают на фиксированные мазки или наливают в кюветы, где расположены препараты. Продолжительность окраски 30 – 40 минут. Затем мазки промывают под струёй воды, сушат и проводят микроскопию. Эритроциты окрашиваются в красный или розовый цвет, протоплазма паразитов и лейкоцитов – в синий, ядра паразитов – в красный, лейкоцитов – в фиолетовый.

11.4.Окраска мазков крови по Май-Грюнвальду без предварительной фиксации. Просушенный на воздухе мазок покрывают куском фильтровальной бумаги и наносят на неё 20 – 25 капель краски Май-Грюнвальда. Через 10 – 15 минут вместе с фильтровальной бумагой с мазка удалят краску, а предметное стекло помещают мазком вниз в чашку Петри на подкладку (спичка, стеклянная трубочка). Наливают водный раствор краски Романовского – Гимза (4 – 5 капель концентрированной краски на 1 мл нейтральной дистиллированной воды). Через 20 – 25 минут мазок тщательно промывают водой и высушивают.

11.5. Простейших (триходины) фиксируют серебрением по Клейну. Слизь с содержащимися в ней паразитами распределяют ровным слоем по покровному стеклу, высушивают на воздухе под чашкой Петри (для предохранения от пыли). Высушенный мазок помещают в чашку Петри (мазком вверх) и на 6 – 8 минут заливают 2%-ным раствором азотнокислого серебра. Затем промывают дистиллированной водой и в чашке Петри, под которую подкладывают лист белой бумаги, ставят на свет. На свету мазки выдерживают до потемнения (4 – 10 часов на рассеянном свету, 30 – 60 минут на ярком солнечном свету), промывают, высушивают и заключают в бальзам.

Для изучения морфологии паразитических инфузорий применяют также окраску железным гематоксилином, гематоксилином Дельфильда или кармином.

Паразитических жгутиконосцев окрашивают железным гематоксилином или по Романовскому-Гимза.

11.6. Слизистых споровиков окрашивают 1%-ным водным раствором метиленовой сини в течении 30 – 60 минут, затем препарат промывают в воде, последовательно проводят через спирты возрастающей крепости (70; 80; 98%-ный и абсолютный) и просветляют ксилолом.

11.7. Из моногенетических сосальщиков (Dactylogyrus, Gyrodactylus) приготовляют глицерин-желатиновые препараты. Для этого паразитов помещают на предметное стекло в небольшой капле воды. Фильтровальной бумагой отсасывают лишнюю воду, добавляют каплю расплавленного глицерин-желатина и покрывают покровным стеклом. Его можно слегка придавить, так чтобы на лежащих в препарате червях были хорошо видны прикрепительные крючья. Для лучшей сохранности препарата по краю покровного стекла наносят специальную замазку (бальзам, лак для ногтей, асфальтный лак и др.).

Приготовление глицерин-желатиновой смеси. 7 г пищевого желатина размачивают в течение 2 – 3 часов в 42 см³ дистиллированной воды, добавляют 50 г чистого глицерина с 0,5 г карболовой кислоты. Полученную смесь нагревают на водяной бане при помешивании до получения однородной жидкости. Полученную жидкость фильтруют в термостате и охлаждают. Фильтрованный глицерин-желатин нужно разлить по небольшим пробиркам, которые всегда держат закрытыми и открывают перед употреблением.

11.8. Трематод и цестод фиксируют 70⁰ спиртом между стёклами. Хорошо профиксированные гельминты становятся непрозрачными и их ткани плотными. В дальнейшем их помещают в пробирки с 70⁰ спиртом и хранят там до момента окраски и определения. Окрашивают трематод и цестод квасцовым кармином. Фиксированные в спирте препараты промывают в течении нескольких часов в проточной или часто сменяемой воде, затем помещают в краску от одной минуты до нескольких часов (в зависимости от толщины гельминта). Продолжительность окраски можно контролировать микроскопией препаратов. Окрашенные препараты переносят в дистиллированную воду, где в течение нескольких минут тщательно отмывают от краски. Отмытых от краски паразитов осторожно сушат фильтровальной бумагой и проводят через спирты возрастающей крепости (70; 80; 98%-ный), выдерживая в них несколько часов. Обезвоженных паразитов просветляют гвоздичным маслом и ксилолом.

Цестод, также как и трематод, можно окрашивать гематеином Майера (1 г гематеина растворяют в 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением 0,2 г йодноватокислого натрия и 50 г калийных квасцов). Гематеин допускает как прогрессивное, так и регрессивное окрашивание (без дифференцировки или с ней). При прогрессивном способе красят только 30 минут, при регрессивном – в течение 24 часов. Во втором случае для дифференциации препарат обрабатывают в 1%-ном солянокислом спирте под контролем микроскопа с последующим тщательным отмыванием краски в проточной воде в течении 20 – 30 минут.

Хорошие результаты получают при окраске цестод молочнокислым кармином. Молочную кислоту разводят вдвое дистиллированной водой, добавляют в неё небольшое количество кармина (в зависимости от желаемой степени окраски), жидкость кипятят. Красить лучше свежие, нефиксированные объекты. Продолжительность окраски контролируют под микроскопом, в случае перекрашивания объект переносят в цельную молочную кислоту для обесцвечивания. Окрашенный препарат промывают в течение 20 – 60 минут водопроводной водой и помещают в бальзам.

Для окраски крупных цестод этот способ модифицирован. Цестод 3 – 4 суток (в холодное время года) и сутки (летом) промывают в проточной или часто сменяемой водопроводной воде при комнатной температуре. Затем гельминтов помещают на 4 – 5 часов в краску (0,3 г кармина на 100 мл 30%-ной молочной кислоты, контролируя интенсивность окрашивания под микроскопом, после чего на сутки их переносят в дистиллированную воду с добавлением в неё трёх капель раствора сернокислого железа и двух капель 1%-ного раствора карболовой кислоты. В дальнейшем цестод переносят на чистое большое стекло, расправляют на нём и высушивают при температуре 30 – 37⁰С (не выше, иначе препарат сморщится). Высушенный, очень плотно приставший к стеклу препарат заливают канадским бальзамом или канифолью, растворённой в смеси, состоящей из равных частей хлороформа и абсолютного спирта.

11.9. Нематод фиксируют горячим спиртом или жидкостью Барбагалло. Указанные реактивы нагревают до кипения в пробирке и выливают в солонку, где находятся фиксируемые объекты. Паразитов перед фиксацией необходимо тщательно очищать от грязи и слизи, так как сделать это после фиксации практически невозможно. Жидкость Барбагалло готовят по рецепту: формалин 40%-ный – 30 см³, поваренная соль – 7 г, дистиллированная вода – 1000 см³.

Для приготовления временных препаратов нематод не окрашивают, а помещают в неразведенную молочную кислоту или лактофенольный раствор (2 части глицерина, 1 часть молочной кислоты, 1 часть карболовой кислоты и 1 часть воды), которые просветляют гельминтов, делая их пригодными для исследования под микроскопом. Мелкие формы гельминтов помещают в 1 – 2 капли молочной кислоты и покрывают покровным стеклом. Через 1 – 2 дня препарат может быть пригоден для исследования под микроскопом. Более крупных нематод в течение 5 – 10 дней просветляют в пробирках, бюксах или бактериологических чашках с молочной кислотой.

Приготовление постоянных микроскопических препаратов нематод осуществляется следующим образом. Фиксированных в 70%-ном спирте нематод переносят через сутки в 96%-ный спирт на несколько часов (в зависимости от величины нематод) и затем в абсолютный спирт на 3 – 5 минут. Из абсолютного спирта нематод переносят в гвоздичное или хеноподиевое масло или карболсилол на 2 – 5 минут, а затем помещают на чистое предметное стекло и заливают бальзамом.

11.10. Скребней (акантоцефалов) фиксируют в 70⁰ спирте. Во время фиксации необходимо следить чтобы хоботок был хорошо вывернут. Для изучения хоботка и крючков скребней просветляют, перенося их из 70%-ного спирта в глицерин (сначала в 50%-ный, затем в чистый). Структуру других органов изучают после полного обезвоживания гельминтов путём постепенного проведения их через спирты возрастающей крепости до абсолютного. Из последнего гельминтов переносят на стекло в каплю кедрового масла, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.

11.11. Паразитических рачков фиксируют в 70⁰ спирте или 4% формалине, не придавливая. Исследуют в той же жидкости, в которой они хранятся. Красить их не обязательно. Иногда прибегают к окраске борным кармином, эозином, сафранином и др.

12. Хранение зафиксированных паразитов. Зафиксированных паразитов помещают в небольшие пробирки, размер которых зависит от величины объекта. В пробирку вкладывают этикетку, где указаны вид рыбы, место локализации, название паразита, место и дата сбора. Этикетку в пробирке помещают так, чтобы её можно было прочесть не вынимая.

13. Показатели поражённости. Результатов исследований по оценке инвазирования рыбы включают следующие показатели:

экстенсивность инвазии - пораженность рыб и рыбной продукции выражается в процентах подсчитывается делением числа зараженных экземпляров на число обследованных с последующим умножением на 100;

интенсивность инвазии - число паразитов в одной конкретной рыбе (в поле зрения микроскопа). Под термином «интенсивность» часто подразумевают и амплитуду интенсивности;

амплитуда интенсивности - величины минимальной и максимальной интенсивности, встречаемые в отобранной выборке (например от 1 до 5 паразитов; обычно записываются через тире: 1-5);

среднее число паразитов на 1 кг массы - рассчитываются путем деления общего числа паразитов в выборке на общую массу ( кг) ;

критическая интенсивность - количество паразитов или паразитарных поражений, при которых 1 экз. рыбы или рыбной продукции определенной массы считается непригодным или ограниченно пригодной для пищевого использования. Величина критической интенсивности устанавливается утвержденными нормативными документами.

14. Нормативные документы для оценки пищевой пригодности рыбы, утверждёные в Республике Беларусь:

- Инструкция 4.2.10-21-25-2006 «Паразитологический контроль качества рыбы и рыбной продукции» утверждена Постановлением Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь 25.10.2006г. №128. Инструкция предназначена для применения в лабораториях органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор за реализуемой рыбой и рыбной продукцией на соответствие требованиям безопасности для здоровья человека по показателям паразитарной чистоты;

- «Правила проведения ветеринарно-санитарной экспертизы рыбы и рыбной продукции» утверждены Постановлением МСХ и П Республики Беларусь 27.04.2004г. №30, зарегистрированы в Национальном реестре правовых актов Республики Беларусь 12 мая 2004г. №8/10966. Правила проведения ветеринарно-санитарной экспертизы рыбы и рыбной продукции устанавливают ветеринарно-санитарные требования при проведении ветеринарно-санитарного контроля рыбы, реализуемой на рынках Республики Беларусь.

Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 382; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

Мы поможем в написании ваших работ!