Препараты, содержащие в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы (бактериальные удобрения, закваски и т.п.)

Лекция 5 Получение конечных продуктов

 

План лекции

1. Виды продуктов микробиологического синтеза.

2. Препараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов (витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики и др.).

3. Препараты, содержащие в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы (бактериальные удобрения, закваски и т.п.).

4. Препараты, содержащие инактивированные клетки и продукты их переработки (кормовые дрожжи, грибной мицелий и т.п.).

Виды продуктов микробиологического синтеза

Микробиологический синтез — промышленный способ получения химических соединений и продуктов (например, кормовых дрожжей), осуществляемый благодаря жизнедеятельности размножающихся микробных клеток.

Некоторые продукты микробиологического синтеза, например, пекарские дрожжи, давно использовались человеком, однако широкое применение микробиологического синтеза началось в 40-50-х гг. 20 в. в связи с освоением производства пенициллина. К этому же времени относится возникновение новой отрасли народного хозяйства - микробиологической промышленности.

Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляции и диссимиляции) образуют новые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием. Обычно продукты жизнедеятельности одноклеточных делят на 4 категории:

- сами клетки как источник целевого продукта. Например, выращенные бактерии или вирусы используют для получения живой или убитой корпускулярной вакцины; дрожжи – как кормовой белок или основу для получения гидролизатов питательных сред и т.д.;

- крупные молекулы (макромолекулы), которые синтезируются клетками в процессе выращивания: ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;

- первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества, необходимые для роста клеток (аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты);

- вторичные метаболиты (идиолиты) – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток (антибиотики, алкалоиды, токсины, гормоны).

Препараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов (витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики и др.)

 

Антибиотики. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются актиномицеты, некоторые грибы и бактерии (в основном их мутантные формы). Антибиотики, употребляемые в медицине, подвергаются высокой степени очистки.

В основе промышленного производства антибиотиков лежит ряд последовательных этапов: получение высокопродуктивных штаммов-продуцентов, разработка наиболее благоприятных ус­ловий культивирования продуцента антибиотика с максималь­ным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику соответствующих методов выделения и очистки антибиотика, создание готовых препаратов и контроль их качества. Каждый из этих этапов должен обеспечиваться соответствующими спе­циалистами (генетиками, микробиологами, технологами и др.).

Промышленный способ получения антибиотиков — сложный многоступенчатый процесс, включающий ряд технологических стадий. Ниже мы рассмотрим из них основные.

Подготовка среды для культивирования продуцента антибиотика и посевного материала (1 стадия). Подготовка среды. Для каждого продуцента антибиотика, для каждого вновь полученного штамма разрабатывается своя оптимальная среда, которая должна отвечать следующим основ­ным требованиям: а) обеспечивать хороший рост продуцента и максимально возможное образование антибиотика, б) содержать доступные и дешевые компоненты, в) обладать хорошей филь­трующей способностью, г) обеспечивать применение наиболее экономичных и эффективных приемов выделения и очистки анти­биотика. Стерилизация питательных сред в промышленных усло­виях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.

Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30— 60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего среда охлаждается до 27—30°С.

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная сре­да из специального сосуда с помощью насоса подастся в стерилизационную колонку, через которую пропускается острый пар (давление пара около 5 атм.). Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидиые прорези, благодаря чему пар поступает в среду и быстро ее нагревает. Среда в колонку подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.

Нагретая в колонке до необходимой для стерилизации температуры (около 130°С) среда поступает в специальный аппа­рат— выдерживатель, где она при температуре 125—130°С вы­держивается определенное время. Время выдержки зависит от состава среды и составляет 5—10 мин. Из выдерживателя стериль­ная среда поступает в змеевиковый холодильник. Здесь она охлаждается до 30—35°С (на выходе) и поступает в ферментер.

Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возможность автоматического ре­гулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и другие факторы.

Подготовка посевного материала — одна из ответственнейших операций в цикле биологического метода получения антибиотиков. Количество и качество посевного материала определяют развитие культуры в ферментере и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивается на богатых по составу средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов.

Биосинтез антибиотика (2-я стадия). Стадия биосинтеза — основная биологическая стадия в про­цессе получения антибиотика. Ее призваны вести и контроли­ровать высококвалифицированные микробиологи.

Задача этой стадии — обеспечение для продуцента антибиоти­ка таких условий развития, которые бы способствовали макси­мальному уровню биосинтеза антибиотика.

Эффективность стадии биосинтеза зависит от уровня образо­вания антибиотика организмом: определяется генетическими особенностями организма, составом питательной среды, режи­мом развития продуцента. Она также зависит от времени макси­мального образования антибиотического вещества, стоимости ком­понентов среды, включая стоимость предшественника, иепогасителей, энергетических затрат, связанных с процессом развития организма-продуцента антибиотика. В энергетические затраты включаются расходы энергии (и ее стоимость), связанные со стерилизацией среды, ферментера и коммуникаций, с перемеши­ванием культуральиой жидкости, продуванием воздуха через нее, и другие процессы.

В современных условиях развития промышленной микробио­логии наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов-продуцентов антибиотиков или других биологически актив­ных соединений является метод глубинного культивирования. При производстве антибиотиков используют периодическое и непрерывное культивирование продуцентов этих биологически ак­тивных веществ.

Ферментеры. Для получения антибиотиков в промышленных масштабах применяются специальные герметически закрытые ем­кости или ферментеры, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов.

Ферментер — это довольно сложный аппарат, обеспечивающий хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинте­за им антибиотика: снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами (рис. 5.1). В последнее время выпускаются ферментеры с ав­томатизированной системой контроля.

Рисунок 5.1 – Ферментер для глубинного выращивания продуцентов антибиотиков: 1 – корпус аппарата, 2 – теплообменник, 3 – гильза для термометра, 4 – барботер, 5 – растяжки для центровки вала, 6 – вал мешалки, 7 – лопасть мешалки, 8 – стойка ферментера, 9 – соединительная муфта вала, 10 – привод мешалки, 11 – мотор

 

Аэрирование культуры в ферментере происходит в результате подачи подогретого до необходимой температуры стерильного воздуха через специальные приспособления — барботеры, а также благодаря перемешиванию культуральной жидкости различного типа мешалками (пропеллерны­ми, турбинными и др.) и наличию отбойников. В последнее время при произ­водстве антибиотиков испыты­вают низкочастотное вибрацион­ное перемещение культуральной жидкости как наиболее экономич­ный способ.

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и прояв­ления им повышенной физиолого-биохимической активности, обес­печивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змееви­ки используются также для пода­чи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.

Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется конт­рольно-измерительной аппарату­рой, позволяющей регулировать скорость перемешивания культуральной среды, поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, ко­личество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автома­тически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабже­ны приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополни­тельных питательных веществ, необходимых для лучшего разви­тия культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.

В промышленных условиях получения антибиотиков приме­няют ферментеры различной емкости — от 500 л до 50, 100 м³ и более. Стерилизацию, производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций проводят перегретым па­ром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или акти­вированным древесным углем.

Подготовка посевного материала — процесс многоступенча­тый. Микроорганизм предварительно выращивают на авизиро­ванной среде в пробирке, затем из пробирки высевают в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубин­ном выращивании на качалках в течение 2—3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры (в колбе) делают посев в небольшой (10 л) инокулятор, а затем хорошо развив­шуюся культуру переносят в более крупный инокулятор (100— 500 л), откуда и производят посев в основной ферментер. Для по­сева в основной ферментер используют от 5 до 10 объемных про­центов посевного материала (инокулята).

Развитие организма-продуцента антибиотика в ферментерах.Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех стадий, очень точном выполнении разработанного регламента условий развития организма-проду­цента антибиотика. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды рН, степени аэрации и скорости работы мешалки. Учи­тывается потребление организмом основных питательных компо­нентов субстрата (источников углерода, азота, фосфора), внима­тельно контролируется образование антибиотика.

Особое внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма часто происходит обильное об­разование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основ­ная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы.

Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителеи используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобуталкарбомил и другие соедине­ния).

Предварительная обработка культуральной жидкости (3-я стадия).В процессе развития микроорганизмов-продуцентов антибиоти­ков эти вещества в большинстве случаев почти полностью вы­деляются из клеток в окружающую среду. Однако в некоторых случаях лишь часть антибиотика выделяется в культуральную жидкость, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма.

В зависимости от того, где антибиотическое вещество со­средоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, не смешивающи­мися с жидкой фазой, или осаждают в виде нерастворимого соединения, или сорбируют ионообменными смолами.

Выделение антибиотика из клеток микроорганизмов осуществляют с помощью экстракции органическими растворителями. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клет­ках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Для этого антибиотик, содержащийся в куль­туральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, а затем антибиотик экстрагируют.

Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. При этом применяют меры для обеспечения лучшей фильтруемости культуральной жидкости (кислотную или тепловую коагу­ляцию, обработку электролитами, внесение различных добавок и т. п.). Для процесса фильтрации применяют различные филь­трующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы.

Фильтр-прессы применяются для обработки больших объемов культуральной жидкости. Эти аппараты состоят из ряда чере­дующихся плит и рам и фильтрующих перегородок между ними. Процесс фильтрации осуществляется под давлением.

Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Первый аппарат работает под вакуумом, второй — в условиях повышен­ного давления над фильтрующейся жидкостью.

Для получения жидкости, освобожденной от взвешенных частиц, широкое распространение нашел способ центрифугирова­ния. Хорошие результаты достигаются при правильном выборе скорости подачи жидкости (лучший вариант—15000 об/мин). Отделение мицелия или других взвешенных частиц может также происходить в сепараторах. При скорости вращения бара­бана сепаратора, равной 7000—7500 об/мин, благодаря центро­бежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированная жидкость стремится к центру барабана и поднимается в специальную камеру.

Выделение и очистка антибиотика (4-я стадия). В процессе образования антибиотика в культуральную жидкость наряду с присутствием в ней различных неиспользован­ных компонентов среды выделяются и разнообразные продук­ты обмена, она обогащается продуктами автолиза клеток. Удаление примесей — первая и весьма важная стадия химической очистки антибиотика.

Стадия выделения и химической очистки включает ряд про­цессов: от обработки нативного раствора до сушки готового очищенного препарата. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и места основного на­копления применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используют экстракцию, осажде­ние, сорбцию на ионообменных материалах, упаривание, сушку.

Одной из особенностей стадии выделения и химической очист­ки является то, что при выделении антибиотиков приходится работать с весьма невысокими концентрациями выделяемого вещества (не превышающими одного процента). В конце стадии химической очистки уже имеют дело с более высокими кон­центрациями антибиотика, достигающими 20—30%.

Цель химической очистки — извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, концентрация его и освобождение (собственно очистка) от сопутствующих приме­сей и в конечном счете получение высоко очищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.

Антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенная температура, высокая кислотность или щелочность и др.) в ряде случаев теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности.

Метод экстракции. Нередко в целях очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристал­лизацией). Такой прием носит название перекристаллизации.

Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрица­тельного заряда иона в них называют катионидами или анионидами. Антибиотик в виде отрицательно заряженного иона будет сорбироваться на катиоиидной смоле, и наоборот. Адсорбирован­ный на смоле антибиотик элюируют (десорбируют), в результате чего получают значительно очищенный и сконцентрированный препарат. Затем раствор препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный за­ряд. При этом примеси осядут на смоле, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку.

Метод осаждения основан на том, что антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами с целью полу­чения соединения, выпадающего в осадок. Полученный осадок с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают, после чего образовавшееся соединение разлагают и антибиотик экстра­гируют или вновь осаждают (кристаллизуют).

Одной из стадий химической очистки антибиотиков является концентрирование полученных растворов путем отгонки большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме.

Применяемые методы выделения и химической очистки, а так­же качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение прежде всего для улучшения качества полу­чаемого антибиотика и для увеличения его выхода.

Получение готовой продукции, приготовление лекарственных форм, расфасовка (5-я стадия).Известно, что к антибиотикам, используемым в медицинской практике, предъявляются очень высокие требования (высокая степень очистки, стерильность препарата и др.). Поэтому на указанной стадии работы, а также при химической очистке пре­парата необходимо соблюдать высокую степень чистоты на всех операциях. Для этого поддерживают в исключительной чистоте не только используемое оборудование, но и помещение, где про­изводят работу.

Антибиотики, предназначенные для инъекций, должны быть стерильными. Поэтому получение таких препаратов, приготов­ление различных лекарственных форм, расфасовка и упаковка осуществляются в асептических условиях.

После выделения и химической очистки антибиотика его необ­ходимо высушить — удалить из полученного препарата свобод­ную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильиы, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потере био­логической активности и не изменяющие цвета препарата.

На современном этапе промышленного получения антибиоти­ков используют различные методы обезвоживания препаратов.

Широкое распространение получила лиофильная сушка антибиотиков, которая проводится при сравнительно низких температурах (-8, -12°С).

Прогрессивным методом при работе с большими количествами антибиотика является высушивание с применением распылитель­ной сушилки. Раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков протекает в течение не­скольких секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют своих свойств.

Сушка зернистых и пастообразных антибиотических препара­тов производится в вакуум-сушильных шкафах или методом взвешенного слоя.

Готовый антибиотик подвергается тщательному биологиче­скому и фармакологическому контролю.

Витамины, провитамин, коферменты. Методом микробиологического синтеза производят в основном витамин В₁₂ и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии. Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В₁₂, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий. Разработаны способы получения витамина В₂, р-каротина и дрожжей, обогащенных эргостеринами..

Получение и применение витамина B₁₂.Мировая продукция витамина В₁₂ составляет 9—11 тыс. кг в год; из них 6500 кг используют на медицинские цели, а осталь­ную часть — для животноводства. Производство витамина В₁₂ основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий, мезофильных и термофильных меганогенных бактерий, а также актиномицетов и родственных форм.

Для получения витамина В₁₂ бактерии культивируют перио­дическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммо­ния. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник — 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фак­тор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения.

Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин В₁₂ сохраня­ется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, под­кисленной до рН 4,5—5,0 при 85—90 °С в течение 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25 %-ной NaNО₂. При получении Кo-В₁₂ стабилизатор не добавляют.

Водный раствор витамина В₁₂ охлаждают, доводят рН до 6,8—7,0 50 %-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al₂(SO₄)₃xI8H₂O и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс.

Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее про­водят дополнительную очистку водного раствора витамина орга­ническими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А1₂O₃. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацето­ном. При этом Кo-В₁₂ может быть отделен от CN- и оксикобаламина.

К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3—4°С 24—48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и сер­ным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Для предот­вращения разложения Ко-В₁₂ все операции необходимо прово­дить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом, можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высо­ким терапевтическим эффектом.

Для химической очистки витамина В₁₂ используется его способность образовывать аддукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделение витамина В₁₂ от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианoкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фе­нола), выделяют комплекс витамина В₁₂ с резорцином (или фе­нолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат.

Аминокислоты. Существенное преимущество микробиологического синтеза аминокислот - возможность их получения в виде природных изомеров (L-форм). Продуцентами аминокислот служат в основном мутанты, лишенные ряда ферментных систем, благодаря чему происходит сверхсинтез необходимого продукта. Обычно используют бактерии, относящиеся к роду Brevibacterium. Больше всего среди аминокислот, вырабатываемых мировой промышленностью, занимают лизин и глутаминовая кислота..

 

 

Препараты, содержащие в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы (бактериальные удобрения, закваски и т.п.)

 

В практике сельского хозяйства препараты из азотфиксирующих бактерий используются в качестве бактериального удобрения: азотобактерин - из культур азотобактера, нитрагин — из культур клубеньковых бактерий

Микроорганизмы, фиксирующие азот из воздуха, подразделяют на свободноживущие в природных условиях и на симбиотические с растениями и другими микробами.

К свободноживущим относят азотобактерии, актиномицеты, к микробным симбионатам-азотоспириллы, симбиоты бобовых растений.

Микробы-азотофиксаторы ежегодно фиксируют примерно 18х10⁷ т молекулярного азота из воздуха, из которых 15% приходится на цианобактерии.

К микробным стимулятороам и регуляторам роста - гиббериллины, фузикокцин, ауксины.

К удобрителям почв можно отнести ризотрофин. Представляет собой торфяную основу, смешанную с ризобактериями. Технологический процесс включает подготовку клубеньковых бактерий и получение инокулята. Инокулят готовят в условиях умеренной аэрации на средах содержащие растительные экстракты и дополнительно вводят неорганические соли фосфаты и карбонаты. Накапливают 5 млрд. клеток в 1 мл. Такую суспензию вносят в “ кислый” торф при 10-15^оС. Торф до “обсеменения” бактериями должен быть гомогенным, подсушенным, увлажненным. В подготовленный торф вносят 50 мл суспензии бактерий, перемешивают во вращающем барабане и сохраняют до полугода при 5-10^оС.

Как регулятор роста применяется в промышленности гиббериллиновая кислота, которая синтезируется микромицетом, относится к группе растительных гормонов сложного химического строения. Образование и накопление гиббериллинов - процесс занимает до 15 суток.

Питательные среды для выращивания содержат 6% глюкозы, глицерина, 0,7% соли аммония, 0,3% неорганический фосфат, микроэлементы. Выход гиббериллинов - 200 мг/л культуральной жидкости.                 

Фузикокцин относят к регуляторам роста растений гормонального типа. Он индуцирует корнеобразование у многих древесных и плодово-ягодных культур, стимулирует прорастание семян, моркови. Фузикокцин образуется грибом. Продукт получают при глубинной ферментации в периодическом режиме на средах с глюкозой или сахаразой и соевой мукой. Затем экстрагируют хлороформом из культуральной жидкости, сорбируют активированным углем, кристализируют.

Заквасками называют чистые культуры или смесь культур микроорганизмов, используемых при изготовлении кисломолочных продуктов и хлебопечении.

В специальных научно-производственных лабораториях выделяют штаммы молочнокислых микроорганизмов, изучают их свойства, селекционируют, составляют и получают закваски, которые направляют на предприятия пищевой промышленности, где вырабатывают производственные закваски.

В цехах по производству заквасок готовят сухой и жидкий бактериальные концентраты, маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок, а также получают натуральные и сухие кефирные грибки (зерна).

Сухой бактериальный концентратв нашей стране чаще вырабатывают трех видов: мезофильных молочнокислых стрептококков, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных молочнокислых палочек. Жидкий бактериальный концентрат готовят из мезофильных молочнокислых стрептококков.

Процесс приготовления сухого бактериального концентрата включает следующие основные этапы: выращивание заквасочных микроорганизмов, бактофугирование полученной культуры, высушивание суспензии клеток, фасование бакконцентрата.

Питательной средой для выращивания молочнокислых бактерий является молочная сыворотка с добавлением кукурузного экстракта (или аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса), буферных солей и стимуляторов роста. В качестве буферных солей используют цитрат натрия или ацетат натрия. Стимуляторами роста молочнокислых бактерий являются сульфат марганца, аскорбиновая кислота и др.

При приготовлении среды в сыворотке устанавливают рН 4,5-4,6 (оптимальную для выделения белков), нагревают ее до 95^оС и выдерживают 60 мин для более полного выделения белков. После этого сыворотку осветляют путем сепарирования.

В осветленную сыворотку добавляют компоненты среды согласно рецептуре, устанавливают оптимальную рН, стерилизуют при 0,05 МПа (112^оС) в течение 60 мин и охлаждают до температуры, оптимальной для роста микроорганизмов.

Стерилизация и охлаждение питательной среды, а также наращивание клеток молочнокислых бактерий осуществляются в ферментере, имеющем мешалку, в котором автоматически регулируются температура и рН на заданном уровне.

В подготовленную стерильную среду, охлажденную до оптимальной температуры развития того или иного вида молочнокислых бактерий, подают закваску в количестве 5-8% (на сывороточной среде) или 3-5% (на обезжиренном молоке).

Наращивание клеток мезофильных молочнокислых стрептококков ведут в ферментере при температуре 30^оС в течение 10-12 ч, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек - при 40°С на протяжении 8-9 ч при автоматическом поддерживании рН. При этом рН культуральной жидкости достигает для стрептококков                                              6,5-6,8, для ацидофильных палочек 5,7-6,0.

После окончания выращивания культуру охлаждают до 3-8°С и направляют на бактофугирование для получения бактериальной массы.

Отделение клеток от среды осуществляют в конце логарифмической фазы роста, когда в культуральной жидкости (в 1 см³) содержатся сотни миллионов - единицы миллиардов активных клеток. Бактериальную массу из культуральной жидкости выделяют на бактофуге. Для этой цели можно использовать центрифугу и молокоочиститель.

Бактериальная масса после бактофугирования содержит сотни миллиардов клеток в 1 см³; выход бакмассы составляет 0,5-0,8 %. Полученную бактериальную массу смешивают с защитной средой в соотношении 1:2 - 1:4. В состав защитной среды для мезофильных молочнокислых стрептококков входят: обезжиренное молоко с содержанием 16 % сухих веществ - 30% и 70 % водного раствора, содержащего сахарозу (5%), желатозу (5%), цитрата натрия (5%), глутамата натрия (2%). В состав защитной среды для ацидофильной палочки вместо цитрата натрия вносят 5 % уксуснокислого натрия. Защитная среда для термофильного стрептококка включает 20 % обезжиренного молока и 80 % водного раствора, содержащего по 2,2 % сахарозы, желатозы, лимоннокислого натрия и 1,2 % глутамата натрия.

Желатоза представляет собой желатин после стерилизации под давлением 0,15 МПа в течение 2,5-3,0 ч. После стерилизации желатин теряет способность образовывать гель.

Полученную суспензию клеток молочнокислых бактерий высушивают. Для этого ее разливают на лотки слоем 6-8 мм или фасуют по 2 см³ во флаконы. Суспензию высушивают в установке для сублимационной сушки сначала при низкой отрицательной температуре —35-(-45)°С, досушивание — при положительной температуре (40-45 °С). Продолжительность сушки суспензии на лотках 6-12 ч, во флаконах 24-42 ч. Сухой бактериальный концентрат, высушенный на лотках, размельчают и фасуют во флаконы порциями по 1-1,5 г.

Концентрат содержит от 150 до 300 млрд клеток в 1 г. Массовая доля влаги в нем не должна превышать 3,5 %. Допускается наличие посторонней непатогенной микрофлоры не более 10 клеток в 1 г.

Приготовление и применение заквасок в производственных условиях.Производственные закваски на предприятии получают в отделениях чистых культур или в специальном боксе при микробиологической лаборатории предприятия. Приготовление производственной закваски из чистых культур проводят в отдельных изолированных помещениях заквасочного отделения.

Закваски и бактериальные концентраты нужно использовать вскоре после получения из специальных цехов или лабораторий. До употребленя их хранят в холодильнике при температуре не выше 8 °С. Нельзя применять закваски и бактериальные концентраты с истекшим сроком хранения, Флаконы с заквасками вскрывают непосредственно перед употреблением и используют все содержимое флакона сразу.

Поступающие на предприятие закваски ослаблены в результате транспортирования и воздействия температуры, поэтому их необходимо восстановить с помощью предварительного культивирования. Эффективная закваска должна проявлять наибольшую активность не позднее чем после второй пересадки. При этом культивирование заквасок необходимо остановить в конце логарифмической фазы, что достигается у большинства заквасок при рН 5,5-5,3 или кислотности 78-80 °Т.

Приготовление производственной закваски из чистых культур на стерильном молоке проводят в молочных бутылках, колбах, в специальных ушатах или бидонах с крышками вместимостью от 3 до 20л.

Режимы приготовления производственных заквасок зависят от вида закваски и конкретных условий производства.

Из жидкой и сухой заквасок или отдельных штаммов на предприятиях готовят материнскую (первичную) закваску, которую используют для получения вторичной или производственной закваски. Для приготовления материнской закваски используют только стерилизованное молоко, для производственной закваски используют стерилизованное и пастеризованное молоко. Активизацию бактериального концентрата проводят на стерилизованном молоке, допускают использование пастеризованного молока.

Производственную закваску получают посевом в подготовленное молоко 20 % (5-7 % для закваски кумыса нежирного) вторичной закваски. Посевы термостатируют при 30°С 4-6 ч, закваску для кумыса нежирного культивируют 14-15 ч.

После каждого культивирования производится дополнительная выдержка заквасок при 16-18°С 3-6 ч (при получении производственно закваски 8-24 ч) для накопления дрожжей.

Бактериальный концентратиспользуют для приготовления производственной закваски или непосредственно продукта после активизации или без активизации (культуры прямого заквашивания).

Для активизации сухой бактериальный концентрат (как сухую закваску) растворяют во флаконе, добавляя в него 6-7 см³ стерилизованного молока или физиологического раствора, полученную смесь переносят в подготовленное молоко. Жидкий бактериальный концентрат перед вскрытием флакона выдерживают при комнатной температуре в течение 20-25 мин. Содержимое флакона переносят в подготовленное молоко из расчета одна порция концентрата на 6-8 л молока.

Активизированный бактериальный концентрат, используемый в качестве производственной закваски, вносят в пастеризованное молоко в соотношении одна порция концентрата (6-8 л) на 2-3 тыс. л молока (мезофильные стрептококки) или одна порция на 500 л (для термофильных бактерий).

В производстве целесообразно использовать свежеприготовленную закваску, так как она обладает наибольшей активностью. В случае необходимости закваску охлаждают до 3-10°С и направляют на хранение. Продолжительность хранения материнской и производственной закваски на стерилизованном молоке до 72 ч, на пастеризованном - 24 ч.

В процессе приготовления продукта производственную закваску на стерилизованном молоке вносят в молоко или сливки в количестве 1-3 %, а закваску на пастеризованном молоке — 3-5 %.

 

 

---

Дата добавления: 2018-06-01; просмотров: 281; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!