СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего образования
«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

АКАДЕМИЯ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ ИМ. Д.И.ИВАНОВСКОГО

ОТЧЕТ

о прохождении учебной /производственной/ практики

Место прохожденияпрактики: Академия биологии и биотехнологии им.Д.И.Ивановского

Вид практики _______________________________________________________

Тип практики_______________________________________________________

Способ проведения практики __________________________________________

Форма проведения практики__________________________________________

Обучающийся_______________________________________________________ ^{(ФИО полностью)}

форма обучения _____________________________________________________

специальность (направление) _____________________________ ___________

^{(подпись)}

Руководитель практики

От профильной организации_________________________________________

МП ⁽^{должность , ФИО полностью)}

Руководитель практики отЮФУ____________________________________

⁽^{должность , ФИО полностью)}

Ростов-на-Дону

20 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ __________________________________________3

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА _________________________4

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ __________ 12

ВВЕДЕНИЕ

Каудексные растения на сегодняшний день активно набирают популярность среди широкой публики, и все чаще их можно встретить не только в оранжереях и ботанических садах, но и в частных коллекциях.

Многие из них содержат различные активные вещества, благодаря чему используются в медицине и фармакологии. Например, Adeniumobesum– ядовитое растение, но имеется информация об использовании малых концентраций для лечения и профилактики раковых заболеваний, и эта тема сейчас активно изучается.

Что касается декоративности данной группы растений, связанной с наличием каудекса (водозапасающего стебля с выраженным утолщением в приземной части), то сохранение каудекса в поколениях возможно только при получении взрослого растения из зародыша (полового или соматического). Утрата габитуса при черенковании обусловлена анатомическим происхождением каудекса у двудольных растений из гипокотиля, который имеется еще на стадии зародыша. Таким образом, сохранение декоративности видов возможно только при семенном размножении или при эмбриогенезе invitro.

Актуальность изучения возможности микроклонального размножения для каудициформных растений обусловливается еще и тем фактом, что в оранжерейной культуре (чаще закрытого грунта) данные виды не приступают к цветению, а некоторые даже при наступившим цветении не способны образовать плоды. Поэтому семенное размножение затруднено, а покупка семян дорога либо недоступна для ряда видов из-за их недоступности на рынке в целом.

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

С 27 апреля 2018 года в рамках преддипломной практики была проведена работа по получению каллуса некоторых каудексных растений коллекции ботанического сада ЮФУ.

Цель представленной работы: получение культуры тканей декоративных каудициформных видов растений из коллекции закрытого грунта Ботанического сада Южного федерального университета.

Задачи работы заключались в том, чтобы:

1). Охарактеризовать по литературным источникам морфолого-анатомические и эколого-биологические особенности каудициформных растений в связи со спецификой размножения.

2). Проанализировать и обобщить опыт клонального микроразмножения избранных каудицифромных видов по литературным источникам.

3). Подобрать схемы стерилизации эксплантов каудициформных растений из числа видов коллекции закрытого грунта Ботанического сада ЮФУ.

4). Провести опыт по получению каллусной культуры исследуемых видов и оценить успешность каллусогенеза в зависимости от состава среды.

В ходе преддипломной практики были окончательно обозначены схемы стерилизации, составы сред и условия содержания ксплантов при микроклональном размножении.

Схема стерилизации была подобрана эмпирическим путем.

Наиболее эффективной оказалась третья схема, при которой эксплант обрабатывался спиртовым раствором 30 с, а затем 7 минут выдерживался в растворе сулемы. Этот вариант обработки позволил минимизировать контаминацию эксплантов. Однако некоторые объекты, в частности Begoniadregei, показали повышенную чувствительность к стандартной схеме. Листовая пластина, используемая в качестве экспланта, в 100 % случаях была сожжена при стерилизации, чего удалось избежать только значительным снижением времени дезинфекции в растворах спирта и сулемы.

Для видов Brachychitonтретья схема стерилизации также оказалась слишком агрессивной.В этом случае уже на вторые сутки после закладки эксплантов на среду они утрачивали зелёную окраску, обесцвечивались, бурели и некротизировались.

В результате последовательных испытаний были разработаны оптимальные схемы стерилизации эксплантов для каждого вида, которые приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Индивидуальные схемы стерилизации эксплантов

№ п/п.	Название вида	Стерилизация
№ п/п.	Название вида	Этанол	Сулема	Дистил. вода
1.	Plumeriarubra	30 с	6 мин	3×15 мин
2.	Pachypodiumlamerei	30 с	7 мин	3×15 мин
3.	Begoniadregei	7 с	5 мин	3×15 мин
4.	Dorsteniafoetida	30 с	7 мин	3×15 мин
5.	Brachychitonacerifolius	15 с	6 мин	3×15 мин
6.	B. populneus	15 с	6 мин	3×15 мин
7.	Adeniumobesum	30 с	7 мин	3×15 мин
8.	Cissustiliacea	20 с	6 мин	3×15 мин

Из данной таблицы видно, что для различных видов оптимальные схемы стерилизации отличаются. Это связано в первую очередь с морфологией листьев, которые были взяты как часть вегетативных органов растений.

Образцы, которые подвергались более агрессивной обработке, не теряя жизнеспособности, обладают кожистыми листьями, часто с легкоотделяемым эпидермисом (такие, как Adeniumobesum). Экспланты этих видов обрабатывались согласно стандартной схеме в течение 30 секунд 70 % этанолом (за исключением циссуса липового, время стерилизации которого раствором этанола было снижено до 20 с.) и затем раствором хлорида ртути в течение 7 мин. Для Plumeriarubra и Cissustiliacea оптимальная продолжительность экспонирования в сулеме составила 6 минут.

В свою очередь, Brachychitonacerifolius и B. populneus, отличающиеся более мягкими листьями, в большей степени сжигались при стерилизации по стандартной схеме. Для них оптимальное соотношение выживаемости и стерильности эксплантов достигнуто при второй схеме стерилизации:

15 секунд в этаноле и 6 минут в растворе сулемы.

Begoniadregeiоказалась видом, наиболее чувствительным к действию стерилизующих агентов, и поддалась культивации invitro только после третьей попытки снижения длительности выдержки листьев в спиртовом растворе. Как видно из таблицы, ее выдержка минимальная из всех апробированных вариантов (7 сек). Бегония требует также наименьшей продолжительности обработки сулемой (5 мин.). В дальнейшем экспланты данного вида перед закладкой на среду обрабатывались согласно первой схеме стерилизации.

Основным общим итогом данного аспекта исследования стал тот факт, что подбор оптимальной схемы стерилизации зависит от морфологии и анатомии листьев. Чем мягче поверхность листа и чем меньше он имеет покровных защитных структур, тем агрессивнее и пагубнее для него обработка спиртовым раствором. Возможно, следует рассмотреть альтернативные пути стерилизации, без использования этанола.

В качестве сред использовались различные модификации среды MS (Мурасиге-Скуга) с различными концентрациями цитокинина 6-БАП (6-бензиламинопурином) и ауксина НУК (1-нафтилуксусная кислота).

На начальном этапе эксперимента получение каллуса Adeniumobesum проходило на экспериментальной среде MS 1/3, которая, кроме стандартного минерального состава, имела соотношение гормонов 1/3: 1 часть БАП, 3 части НУК, 250мкл/л и 750 мкл/л соответственно.

На данном этапе исследования был получен каллус Adeniumobesum. Процесс каллусогенеза занял около 4 недель.

Однако первую пересадку каллус A. obesum не перенёс. Наблюдались повышенный уровень заражения материала и снижение его жизнеспособности – даже в отсутствии грибковых и бактериальных контаминаций каллус погибал.

После нескольких неудачных попыток ввести каллус в культуру на тот момент опыт прекратился.

Основной этап эксперимента включал два варианта состава среды. Первый (MS 1/3) совпадает составом, приведённым выше. Второй испытанный вариант состава среды –MS 2:1, в которой использовались 2 части БАП и 1 часть НУК, 1000 мкл/л и 500 мкл/л, соответственно. Выбор приведённых выше концентраций фитогормонов обоснован использованием сред данного состава в исследованиях, посвященных микроклональному размножению конкретных видов (Krogstrup, 2005, 2006; Kanchanapoom, 2010). Приводимые авторами результаты показывают, что данные соотношения фитогормонов стимулируют каллусогенез практически в 100% случаях и таким образом являются максимально эффективными.

На данном этапе исследования были получены каллусные массы всех вовлечённых в эксперимент каудициформных видов из оранжерейной коллекции, однако каллусогенез различных образцов осуществлялся на двух вариантах сред с неодинаковой успешностью. Некоторые виды образовывали каллус на обоих вариантах, некоторые – только на одной из них. Успешность каллусогенеза, представленная временем начала каллусообразования и длительностью поддержания в культуре, отражена в таблице 2.

Таблица 2 – Успешность каллусогенеза исследуемых видов

№ п/п	Название вида	MS 1/3		MS 2:1
№ п/п	Название вида	Время начала каллусо-генеза, сут.	Длительность поддержания в культуре, нед.	Время начала каллусо-генеза, сут.	Длительность поддержания в культуре, нед.
1.	Plumeriarubra	_	_	30	5,5
2.	Pachypodiumlamerei	_	_	21	4
3.	Begoniadregei	24	5	_	_
4.	Dorsteniafoetida	28	5	21	4,5
5.	Brachychitonacerifolius	28	5	24	7
6.	B. populneus	_	3,5	28	7
7.	Adeniumobesum	21	4,5	_	3,5
8.	Cissustiliacea	10	5	10	5

Анализ данных таблицы показал следующее.

«Рекордсменом» как по скорости, так и по успешности образования каллуса стал Cissustiliacea. Срок появления каллуса этого вида составил 10 суток на любой из сред. Культура ткани циссуса оставалась стабильной на протяжении 5 недель. Размеры каллуса на местах срезов листовых пластин достигали 3 мм уже на 2-3 неделю культивирования. Визуально каллус отличался стабильной жизнеспособностью.

Наблюдаемая картина может быть обусловлена фенологическим состоянием циссуса на момент взятия экспланта. В конце июня 2017 г., в момент изъятия образцов, Cissustiliacea находился на стадии возобновления вегетации после состояния покоя, со сброшенными старыми листьями, тогда как взятый в качестве экспланта лист был из числа молодых, только что появившихся. В то же время остальные вовлечённые в эксперимент виды находились в стадии затухания активного роста, и эксплантами этих видов выступали взрослые, полностью сформировавшиеся листья. Это может подразумевать, что растение циссуса было в состоянии более высокой физиологической активности по сравнению с остальными, что, несомненно, также могло оказать влияние на результат эксперимента. Однако, поскольку сравнительных экспериментов не было проведено, на данном этапе работы невозможно сделать однозначные выводы.

Время появления первых признаков каллусогенеза у остальных видов оказалось более растянутым – от 21 до 30 суток. В частности, наиболее позднийкаллусогенез наблюдался у Plumeriarubra и составил 30 суток. Однако в культуре invitro удалось поддерживать листовой эксплант данного вида достаточно долго – около 5 с половиной недель.

Для Dorsteniafoetida, Brachychitonacerifolius, B. populneus также оказался характерным длительный период перед началом каллусообразования. Первые визуальные признаки появления каллуса наблюдались на 24 – 28 сутки культивирования.

Dorsteniafoetida показала большую активность на среде с большим содержанием цитокининов (MS + 1000 мкл/л БАП и 500 мкл/л НУК).Каллусогенез в этом случае начался уже спустя 21 сутки, тогда как на среде состава MS + 250 мкл/л БАП и 750 мкл/л НУК его первые признаки были отмечены лишь на 28 сутки. Однако длительность поддержания эксплантов на среде MS 1/3 оказалась несколько меньше – 4,5 недели против 5 на среде MS 2:1.

Brachychitonacerifolius также показал большую скорость образования каллуса на среде MS 2:1, к тому же длительность содержания в культуре на данном варианте среды была больше – около 7 недель. В то же время на среде MS + 250 мкл/л БАП и 750 мкл/л НУК Brachychitonacerifoliusподдерживался 5 недель и при этом образовал каллус на 28 сутки культивирования.

B. populneusвовсе не показал каллусогенеза на среде MS + 250 мкл/л БАП и 750 мкл/л НУК. Экспланты теряли жизнеспособность раньше, чем образовывался каллус. Это сопровождалось потерей листовым эксплантом зеленого цвета, жизнеспособного вида и потемнением, что наблюдалось через несколько недель после посадки на среду и не сопровождалось видимыми признаками бактериального или грибкового заражения. Поскольку гибель эксплантов брахихитона тополёвого наблюдалась через несколько недель после посадки на среду, потеря жизнеспособности также не может быть обусловлена стерилизацией, т. к. последствия стерилизации проявляются значительно раньше, спустя несколько дней. Можно сделать заключение, что среда MS 1/3 неспособна не только стимулировать каллусогенез, но также поддерживать экспланты данного вида в жизнеспособном состоянии сколько-нибудь длительное время.

Одновременно с этим, на среде состава MS 2:1 удалось зарегистрировать начальные фазы получения каллусогенеза B. populneus. Сроки его появления составляют 28 суток, предельное время поддержания в культуре – 7 недель. Эти данные в целом согласуются с показателями каллусообразования у другого исследованного вида брахихитона.

Однако следует отметить, что каллус у B. populneusимел крайне малые размены и концентрировался вдоль среза листовой пластины. Это явление может быть аналогичным спонтанному развитию травматического каллуса, которое наблюдается при поранениях стеблей и стволов ряда растений. С другой стороны, развитие каллуса вдоль среза также может свидетельствовать об анатомических затруднениях прохождения фитогормонов через покровные ткани листа, связанные с его жесткостью. В результате каллус образовывался на местах прямого доступа среды к тканям листа, а именно на местах срезов.

Adeniumobesum в ходе эксперимента показал каллусогенез на среде MS 1/3, что соответствует результатам опыта 2016 г. по культуре ткани адениума. На среде MS 1/3 данный вид начинал образовывать каллус уже на 21 сутки, в то время как на среде MS 2:1 каллусогенеза не наблюдалось и через 3,5 недели листовой эксплант погибал.

Pachypodiumlamerei, как брахихитон тополёвый,образовывал незначительного размера каллус по краю экспланта, что также может быть обусловлено анатомо-морфологическими особенностями строения листовых пластин. Однако в отличие от листа Adeniumobesum,у Pachypodiumlamereiи B. populneusне наблюдалось легко отделяемых слоев покровных тканей, удаление которых способствовало бы увеличению площади соприкосновения экспланта со средой.

По результатам сравнения успешности культивирования эксплантов и получения каллуса на средах двух различных составов можно отметить, что реакция исследованных видов была индивидуальной. В частности, у обоих видов брахихитона более короткие сроки начала образования каллуса и большая продолжительность его поддержания наблюдались на среде с большим содержанием цитокининов, нежели ауксинов. Аналогичным образом на среде MS 2:1 проявили себя экспланты дорстении. Обратная картина наблюдалась для адениума, который в течение трёх лет эксперимента успешно образовывал каллус на среде состава MS 1/3.

В результате эксперимента были получены каллусные массы всех выбранных видов. Однако не для всех объектов каллус был получен на обоих вариантах сред. Длительность каллусогенеза различается в зависимости как от видовой принадлежности образца, так и от гормонального состава использованных сред.

Однако необходимо отметить, что для большинства изучаемых видов, за исключением Cissustiliacea, полученные размеры каллусной массы были весьма незначительны. Попытка субкультивирования каллуса на среду того же состава успешных результатов на данный момент не дала. При пересадке образовавшихся каллусных масс наблюдалась потеря ими жизнеспособного вида, цвета и последующая гибель. Для дальнейшего эмбриогенеза и получения полноценных растений регенерантов требуется продолжение эксперимента.

Наиболее перспективным видом в данной работе оказался Cissustiliacea однако пока невозможно достоверно сказать, что послужило причиной настолько быстрого каллусогенеза – правильно подобранные условия или фенологическая фаза объекта на момент сбора листовых эксплантов, либо же совокупность обоих этих факторов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Бабикова А. В., Горпенченко Т. Ю., Журавлев Ю. Н. Растение как объект биотехнологии // Комаровские чтения. Ежегодные чтения (конференции) в память основателя академической науки на Дальнем Востоке России Владимира Леонтьевича Комарова. – 2007. – №. 55. – С. 184 – 211.

2. Батыгина Т. Б., Васильева В. Е., Маметьева Т. Б. Проблемы морфогенеза invivo и invitro. Эмбриоидогенез у покрытосеменных растений // Ботанический журнал. – 1978. – Т. 63, №. 1. – С. 87 – 111.

3. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2002. – 232 с.

4. Батыгина Т. Б. Эмбриогенез и морфогенез половых и соматических зародышей // Физиология растений. – 1999. – Т. 46, №. 6. – С. 884 – 898.

5. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. – М.: Наука, 1964. —272 с.

6. Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений. – М.: Наука, 1984. – С. 42 – 54.

7. Бутенко Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе: монография. – М.: ФБК-Пресс, 1999. – 159 с.

8. Васильев А.Е. Ботаника. Анатомия и морфология растений. Учебное пособие / А.Е. Васильев, Н.С. Воронин, А.Г. Еленевский, Т.И. Серебрякова. – М.: Просвещение, 1988. – 478 с.

9. Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В. Современные проблемы и методы биотехнологии. Электрон.учеб. – Красноярск: ИПК СФУ, 2009.

Дата добавления: 2018-06-27; просмотров: 107; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

Мы поможем в написании ваших работ!