Основные технические характеристики микроскопа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ университет Факультет пищевой БИОТЕХНОЛОГИИ и ТОВАРОВЕДЕНИЯ   Кафедра «Технология и товароведение продуктов питания»    

Л.А.Самофалова

 

Методические указания

по выполнению практических работ

 

Дисциплина – «Введение в специальность»

Специальность - 240902 – «Пищевая биотехнология»

 

Печатается по решению редакционно-

Издательского совета ОрелГТУ

Орел 2008

Автор: кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология и товароведение продуктов питания» Л.А. Самофалова

 

Рецензент: кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология и товароведение продуктов питания» Орловского государственного технического университета А.П. Симоненкова

 

Методические указания предназначены для студентов специальности  240902 – «Пищевая биотехнология» очной формы обучения. Включают практические занятия по дисциплине «Введение в специальность». В ходе проведения работы студенты должны овладеть навыками работы с микроскопами, изучить строение животной и растительной клетки, бактерий, вирусов, грибов, ознакомиться с понятиями пищевой и биологической ценности продуктов питания, формулой сбалансированного питания, овладеть расчётами биологической и энергетической ценности по белковому составу важнейших продуктов питания.                                                    

 

 

Редактор <__________________>

Технический редактор <инициалы, фамилия>

 

Орловский государственный технический университет

Лицензия ИД №00670 от 05.01.2000 г.

 

Подписано к печати <дата>. Формат 60х84 1/16.

Печать офсетная. Уч. печ. л. <6,1>. Усл. печ. л. <число>. Тираж <число> экз.

Заказ № <число>

Отпечатано с готового оригинал-макета

на полиграфической базе ОрелГТУ,

г. Орел, ул. Московская, 65.

 

 

ã ОрелГТУ, 2008г.

Тема 1. ИЗУЧЕНИЕ УСТРОЙСТВА МИКРОСКОПА, ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

1.1. Цель работы:

- ознакомить студентов с принципами работы и устройством светового и электронного микроскопов;

- познакомится с принципами работы микроскопов для различных областей научной и производственной деятельности;

- изучить правила работы с микроскопами.

 

Общие теоретические сведения

Изучение невидимых невооружённым клеток микроорганизмов, размеры которых не превышают десятков и сотен микрометров (1 мкм = 0,001 мм), возможно только с помощью микроскопов. Эти приборы позволяют получать увеличение в сотни (световые микроскопы) и десятки-сотни тысяч раз (электронные микроскопы) изображение исследуемых объектов.

С помощью микроскопа изучают морфологию и строение клеток микроорганизмов, их рост и развитие, проводят первичную идентификацию исследуемых организмов, ведут наблюдение за характером развития микробных ценозов (сообществ) в почве и других субстратах. Микроскоп может быть использован в различных областях медицины (гематологии, дерматологии, урологии, пульмонологии и т.д.) при диагностических исследованиях в клиниках и больницах.

 

Устройство микроскопа

Микроскоп состоит из двух частей: механической (подсобной) и оптической (главной).

Механическая часть состоит из штатива, предметного столика и тубуса.

К штативу примыкает коробка механизмов, система зубчатых колёс для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов.

Макрометрический винт (кремальера, зубчатка, макровинт) служат для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта на фокус.

Микрометрический винт (микровинт) используют для последующей более чёткой установки на фокус. При полном повороте микрометрического винта тубус передвигается на 0,1 мм (100 мкм). При вращении винтов по часовой стрелке он опускается по направлению к препарату, при вращении против неё от препарата.

 На предметный столик помещают препарат с объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре него находится отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалами микроскопа. На столике вмонтированы два зажима (клеммы) – пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления препарата.

Тубус – оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней его части прикрепляют револьвер (объективодержатель) с гнёздами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика.

Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла, (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Все части оптической системы строго центрированы в отношении друг друга. Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света.

Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая – вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться только плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений.

Конденсор, состоящий из 2-3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим, прежде всего,  при работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединённую с зубчатым механизмом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом. Для регулирования интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок. Для получения более чёткого изображения исследуемого объекта важно отрегулировать степень раскрытия диафрагмы.

Под конденсором располагается кольцевидный держатель для светофильтров (синее и белое матовые стёкла). При работе с искусственным источником света светофильтры создают впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее утомительным для глаз.

Объектив – наиболее важная часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. Напужная линза обращена плоской стороной к препарату, называется фронтальной, она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов.

Один из таких недостатков явление сферической аберрации. Оно связано со свойством линз неравномерно преломлять периферические и центральные лучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые и поэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе. В результате изображение точки приобретает вид расплывчатого пятна.

Хроматическая аберрация возникает при прохождении через линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломляясь по-разному, лучи пересекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.

Существуют объективы - ахроматы, устраняющие сферическую аберрацию и частично хроматическую. Они содержат до 6 линз и частично коррегируют первичный спектр (жёлто-зелёную часть спектра), но не устраняют вторичного спектра. Апохроматы – объективы, устраняющие хроматическую аберрацию и для вторичного спектра. В их составе может быть до 12 линз.

Объективы бывают сухие и погружные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом находится воздух. Оптический расчёт иммерсионных объективов предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в жидкую однородную среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы показателя преломления стекла (1,52) и воздуха 1,0 часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. При работе с иммерсионным объективом необходимо между покровным стеклом и линзами объектива поместить кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла.

Объективы различают по их увеличению, соответствующие обозначения наносят на их оправу. Каждый объектив характеризуется определённой величиной рабочего расстояния в мм.

 У объективов с малым увеличением расстояние от фронтальной линзы объектива до препарата больше, чем у объективов с большим увеличением. В зависимости от этого необходимо строго следить, каким винтом (макрометрическим или микрометрическим) следует пользоваться при фокусировке объектива. Так, объективы с увеличением 8х, 40x и 90х имеют соответственно рабочие расстояния 13,8; 0,6; 0,12 мм. Иммерсионный объектив имеет рабочее расстояние до объектива 0,12 мм, поэтому его нередко называют «близоруким». У объективов малых увеличений не только большие рабочие расстояния, но и большие поля зрения. В связи с этим, рекомендуется исследование препарата начинать с небольшого увеличения. Объективы рассчитаны на работу с покровным стёклом толщиной 0,17±0,1 мм. Если стекло не соответствует стандарту, необходимо регулировать объектив вращением кольца коррекционной оправы, которой оснащены современные высококачественные объективы. При отсутствии такой оправы сферическую аберрацию, вызываемую покровным стеклом. Следует устранить, поднимая или опуская тубус микроскопа.

 Одна из важных характеристик объектива – разрешающая способность, определяющая в конечном итоге разрешающую способность микроскопа в целом. Она определяет наименьшее расстояние между двумя точками на препарате, которые будут видны раздельно. Разрешающая способность объектива зависит от его числовой апертуры и длины волны света, при которой идёт наблюдение объекта. Числовая апертура объектива характеризует светособирательную способность его.

Окуляр является как бы непосредственным продолжением человеческого глаза и представляет собой двояковыпуклую линзу. Окуляр состоит из двух линз – глазной (верхней) и полевой или собирательной (нижней), заключённых в металлическую оправу. Назначение полевой линзы – собирать лучи, идущие от объектива, таким образом, чтобы они проходили через маленькое отверстие главной линзы. Назначение окуляра - в прямом мнимом увеличении действительного обратного и увеличенного изображения, которое даёт объектив. Рабочее увеличение окуляров колеблется в пределах от 4х до 15х.

При длительной работе с микроскопом следует пользоваться двойными окулярами  - бинокулярной насадкой. Бинокулярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5х) и снабжены коррекционными линзами. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55-75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя.

 

Задание:

Пользуясь приложением 1, 2 зарисовать микроскоп,  выписать определение составных частей светового микроскопа, выписать правила его настройки.

Контрольные вопросы:

1. Каково назначение микроскопов?

2.Перечислите основные типы микроскопов

3.Какие физические законы в основе устройства микроскопа?

4.Перечислите основные части микроскопа

5.Как устроена механическая частьмикроскопа?

6. Как устроена оптическая часть микроскопа?

7. Как устроен объектив? Назовите типы объективов, что такое аберрация объектива?

8. Что такое «разрешающая способность микроскопа»?

9. Каково назначение и устройство окуляра? Назовите рабочее увеличение окуляров

10. Для чего нужны бинокулярные насадки?

 

Основные технические характеристики микроскопа.

Качество микроскопа определяется его увеличительной и разрешающей способностями.

Коэффициент увеличения микроскопа определяется произведением увеличения окуляра (К) и увеличения объектива (V) и выражается формулой:

                                       D=KV                                               (1)

Теоретически микроскоп может дать увеличение 2000х и более раз. Однако, следует различать полезное и бесполезное увеличение микроскопа. Пределы полезного увеличения в обычно используемых микроскопах достигают 1400х. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света, которые незаметны в пределах полезного увеличения, но приводят к оптическим ошибкам в зоне бесполезных увеличений. Увеличение, которое даёт возможность рассматривать объект под предельным углом зрения и есть полезное увеличение. Оно обычно превышает числовую апертуру объектива в 500-1000 раз. Например, для объектива с увеличением 40х, имеющего числовую апертуру 0,65, полезное увеличение составляет 325-650х. С помощью этого увеличения можно различить все структуры, разрешаемые данным объективом. Поэтому для объектива 40х следует брать окуляр 15х, чтобы получить увеличение в пределах полезного. Какие бы более сильные окуляры не применялись, более тонких деталей структур выявить не удаётся. Более того, применение окуляра с большим увеличением приведёт к уменьшению количества света, попадающего в глаз наблюдателя, и возрастанию искажений, вызываемых дефектами зрения.

Если объектив имеет увеличение 90х (числовая апертура 1,25), то полезное увеличение для него равно х1250. Следовательно, и здесь не надо применять окуляры с увеличением более 15х, чтобы не выходить за пределы полезного увеличения. Бесполезные увеличения могут принести пользу лишь при подсчёте мельчайших частиц в поле зрения, если при этом не требуется рассмотрения их структуры.

Разрешающая способность микроскопа. Эта характеристика особенно важна при исследовании микрообъектов и их структур.

Если увеличительная способность микроскопа зависит от объектива и окуляра, то разрешающая способность определяется главным образом объективом и конденсором.

Расчёт разрешающей способности микроскопа проводят по формуле:

                                                  d=λ/2A                                           (2)

Максимальная разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм.

Примеррасчёта разрешающей способности микроскопов.

Если увеличение объектива 40х, А= 0,65, то

d = 0,55мкм/(2 х 0,65) = 0,42 мкм

Если V объектива 90х, А = 1,25, то

d = 0,55мкм/(2 х 1,25) = 0,22 мкм

Разрешающая способность микроскопа тем лучше, чем меньше абсолютная величина d.

 

Задание:

1)Определить какой окуляр необходимо выбрать для объектива 40х, апертура 0,65; 90х, апертура 1,25;

2) Пользуясь справочным руководством по микроскопам МИКМЕД-1 выписать  размеры объективов, апертуру, выбрать окуляры с полезным увеличением.

 

Контрольные вопросы:

1. Что такое «увеличительная способность микроскопа», как её определить?

2. Что такое «полезное « и «бесполезное» увеличение микроскопа?

3. Как определить разрешающую способность микроскопа? Какова максимальная разрешающая способность светового микроскопа?

4. Как построен окуляр, назовите его главные части?

5. Каково назначение и как построена бинокулярная насадка?

 

Работа с микроскопом.

Основные прави­ла работы с микроскопом. Место для микроскопа выбирают подальше от прямого солнечного света. Работа на столе с темной поверхно­стью меньше утомляет глаза. Лучше смотреть в окуляр левым глазом, не закрывая правого.

В случае работы с бинокулярной насадкой сначала регулируют расстояние между окулярами в соответствии с расстоянием между глазами наблюдателя так, чтобы поля зрения обоих окуляров слились в одно.

Переносить микроскоп необходимо двумя руками: одной держать штатив, другой — основание микроскопа. Следует предохранять микроскоп от толчков, соприкос­новения с сильнодействующими веществами типа кис­лот, щелочей. Не рекомендуется вынимать окуляр из трубы, чтобы не загрязнять пылью трубу и объективы. Во время работы желательно защищать микроскоп от дыхания, так как конденсация паров ведет к его порче.

Линзы должны быть всегда чистыми. Микроскоп сле­дует хранить в чехле. Нельзя касаться пальцами опти­ческих поверхностей.

Работа с иммерсионной системой мик­роскопа. При работе с иммерсионным -объективом (У=90х; А=1,25) необходимо установить зеркало плос­кой стороной и поднять конденсор.

Каплю иммерсионной жидкости (кедрового масла) наносят на препарат, не размазывая ее по стеклу. По­гружать в иммерсионную жидкость можно только им­мерсионные объективы (не сухие).

Глядя сбоку на предметное стекло, опускают объ­ектив до поверхности масляной капли. Далее, глядя в окуляр, опускают объектив осторожно при помощи мак­ровинта, следят при этом за появлением изображения, а затем, когда оно появится, пользуются микровинтом. Если изображение нерезкое, тусклое или плывет, что-то сделано неправильно: загрязнена фронтальная линза объектива, мешают пузырьки воздуха в масле, случай­но закрыта диафрагма, сдвинута лампа или зеркало. Причину некачественного изображения надо устранить.

По окончании работы поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива хлопчатобумажной салфеткой, смоченной очи­щенным бензином.

Иммерсионную жидкость (кедровое масло) рекомен­дуют хранить в специальных двухкамерных масленках. В наружную камеру наливают ксилол или очищенный бензин для очистки объективов от масла, во внутрен­нюю - кедровое масло. Камеру с маслом герметично закрывают пробкой, в которую вставляют стеклянную палочку для нанесения капли масла на препарат.

Установка освещения. Удобнее пользоваться искусственным источником света — он более постоянен, чем дневной, лучше освещает объект, что важно при работе с сильными объективами (90х).

Освещение препарата по Келеру. Рациональное ос­вещение объекта достигается при использовании осве­тителей типа ОИ-7, ОИ-9 и ОИ-19. Осветитель с низко­вольтной лампочкой устанавливают на расстоянии 25-30 см от микроскопа с помощью соединительной планки (крестовины). Полевая диафрагма осветителя открыта; используют объектив х8, зеркало с плоской поверхно­стью, конденсор поднят.

Препарат в поле зрения микроскопа фокусируют при открытых диафрагмах осветителя и конденсора. Из ос­ветителя удаляют матовое стекло. Полевую диафрагму осветителя закрывают. На зеркало помещают белый лист бумаги для получения четкого изображения нити лампы осветителя.

Движением зеркала перемещают световой поток в поле зрения микроскопа. Фокусируют препарат. Опус­кают конденсор до тех пор, пока изображение (проек­ция) краев полевой диафрагмы осветителя в плоскости препарата не станет четким. Центрируют легкими дви­жениями зеркала изображение отверстия диафрагмы. Наблюдая в микроскоп, постепенно открывают полевую диафрагму осветителя так, чтобы освещенный круг ее заполнил все поле зрения микроскопа; лучше, если он немного выйдет за пределы поля зрения.

Положение осветителя, зеркала, конденсора микро­скопа в дальнейшем не менять.

Установку света по Келеру рекомендуют также ипри темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Измерение объектов. Измерять клетки мик­роорганизмов (в мкм) можно на фиксированных и жи­вых препаратах с помощью шкалы окулярного микро­метра - окулярной линейки. У кокков определяют диа­метр клеток, у других форм бактерий - длину и ши­рину.

Окулярная линейка — круглая стеклянная пластин­ка, посредине которой нанесена шкала делений (50 или 100 делений) общей длиной 5 мм. Вывинчивают линзу окуляра и окулярную линейку вставляют шкалой вверх на диафрагму окуляра. Ставят препарат и определяют, скольким делениям линейки соответствует длина и ши­рина клетки. Измеряют не менее 10-20 клеток.

Чтобы рассчитать истинные размеры клеток, определяют цену деления окулярной линейки с помощью объектного микрометра, который представляет собой металлическую пластинку в форме предметного стекла с отверстием в центре; в отверстие помещено стекло с линейкой (шкала из 100 делений). Общая длина шкалы объектного микрометра 1 мм, величина одного деления 10 мкм (0,01 мм).

Объектный микрометр помещают вместо препарата на столик микроскопа, фокусируют изображение линей­ки при малом увеличении, затем перемещают в центр поля и меняют объектив на тот, при котором измеряли клетки. Перемещая столик микроскопа и поворачивая окуляр, устанавливают объектный и окулярный микро­метры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна перекрывала другую. Определение цены деления оку­лярного микрометра проводят по принципу нониуса, т. е. совмещают одну из черт шкалы окулярного мик­рометра с чертой объектного микрометра и находят сле­дующее совмещение. Допустим, в двух делениях объект­ного микрометра (20 мкм) умещается пять делений окулярного микрометра, тогда одно деление окулярного микрометра при данном увеличении равняется 4 мкм (20:5).

Зная, скольким делениям окулярной линейки соот­ветствует длина и ширина изучаемых клеток, умножа­ют цену деления окулярного микрометра на эти числа. Вычисленные значения цены делений линейки справед­ливы только для данной системы окуляр - объектив.

 

Задание:

Согласно правилам установить световой микроскоп, фокусировать препарат. Отрегулировать положение осветителя, зеркала, конденсора.

Контрольные вопросы:

1. Где должен устанавливаться микроскоп?

2. Как устанавливается бинокулярная насадка?

3. Каковы меры предосторожности при работе с микроскопом?

4. Назовите правила работы с иммерсионной системой.

5. Как проводится установка освещения по Келеру?

Микроскопия в тёмном поле

В основе метода лежит явление Тиндаля — освеще­ние объекта косыми лучами света. Эти лучи, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит темным. В то же время оптиче­ски неоднородные клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой степени, что лучи попадают в объектив. По­скольку лучи света идут именно от объектов, наблюда­тель видит их в темном поле интенсивно светящимися.

Темное поле зрения можно создать в светооптическом микроскопе, заменив обычный конденсор темнопольным и применив источник сильного света. Однако, эффект тёмного поля может быть достигнут только в том случае, если апертура конденсора превышает на 0,2—0,4 единицы апертуру объектива. Для исследова­ния в темном поле рекомендуют конденсор с апертурой около 1,2 и объективы с апертурой 0,65—0,85. Важно обращать внимание на толщину предметных (0,8— 1,2 мм) и покровных (0,17 мм) стекол, толщину пре­парата (в воде) и чистоту используемых стекол. Чем толще препарат и чем больше в нем посторонних ча­стиц, преломляющих световые лучи, тем менее контраст­но получаемое изображение, так как каждая частица, отражая лучи, освещает поле зрения.

Метод используется при исследовании живых кле­ток микроорганизмов. Особенно он ценен для функцио­нально-морфологического изучения крупных объектов типа дрожжей. Цитоплазма дрожжевых организмов (при условии яркого источника света и хорошего апо-хроматического иммерсионного объектива) слабо и рав­номерно опалесцирует. На ее фоне четко различаются черные, оптически пустые вакуоли. Капли жира выде­ляются как сильно блестящие гранулы. Протопласт погибающих клеток опалесцирует молочно-белым цве­том.

 

Контрольные вопросы:

1. В каких случаях применяется микроскопия в тёмном поле?

2. Чем отличается конструкция тёмнопольного микроскопа от обычного светового?

3. Какой конденсор и какие объективы применяют в тёмном поле?

 

---

Дата добавления: 2018-04-05; просмотров: 3047; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!