СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ И ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ
ЗАНЯТИЯЕ 1.1.2
Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия
Цель занятия:
Изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; овладеть методами приготовления и окраски микропрепаратов.
Студент должен знать:
1. Основные формы и размеры бактерий.
2. Постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки.
Функциональное значение отдельных структурных компонентов.
3. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Химический состав. Функции.
4. Протопласты, сферопласты и L-формы бактерий.
5. Механизмы взаимодействия красителей с клеточной стенкой бактерий в
окраске по Граму.
6. Методы изучения микроорганизмов в нативном и окрашенном состоянии.
Простые и сложные методы окрашивания. Методы Грама, Циля-Нильсена,
Ожешко, Нейссера, Бурри-Гинса, Романовского-Гимза.
Студент должен уметь:
· приготовить нативные и фиксированные препараты
· окрасить препараты простым методом и методом Грама.
Студент должен владеть:
· методами микробиологических исследований с использованиеммедико-технической аппаратуры;
· методом окраски бактерий по Граму
Работа № 1.Формы иразмерыпрокариот и эукариот
Цель: сравнить формы и размеры прокариот и эукариот на примере кишечной палочки,стрептококка, стафилококкаи грибов рода кандида(см. теоретическую справку).
|
|
|
Самостоятельная работа:микроскопировать готовые препараты-мазки, зарисовать, описать и сделать вывод.
Результат:
Кишечная палочка
Результат:
СтрептококкРезультат:
Кандидаи стафилококк
Вывод:
Работа № 2. Строение бактериальной клетки и структура клеточной стенки
Цель:изучить строение бактериальной клетки и структуру клеточной стенки бактерий; освоить технику приготовления фиксированных препаратов.
Самостоятельная работа:приготовить мазок из смеси культур стафилококка и кишечной палочки и окрасить по Граму (см. теоретическую справку). Оценить морфологические и тинкториальные свойства. Зарисовать, описать и сделать вывод.
Результат:
Вывод:
Работа № 3. Непостоянные структуры бактериальной клетки – жгутики.Техника приготовления нативных препаратов для изучения живой культуры бактерий.
Цель:выявить форму и характер подвижностибактерий.
Самостоятельная работа: по характеру движения микроорганизмов определить наличие и расположение жгутиков.
|
|
|
Препараты
«висячая» капля «раздавленная» капля
вибрионы кишечные палочки
Результат:
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:
Подпись преподавателя_________________________________________________________
Самостоятельная работа во внеурочное время
1. Дать определение:
а) морфологические свойства - __________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________б) тинкториальные свойства - ____________________________________________________
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Подписать постоянные и непостоянные компоненты бактериальной клетки (постоянные –синим цветом, непостоянные - красным)
Схема строения бактериальной клетки:
1. Дать характеристику перечисленных структурных компонентов бактериальной клетки, методы их выявления.
|
|
|
4. Подписать компоненты клеточной стенки Грам+ и Грам-бактерий, обозначенные стрелками
Схема строения клеточной стенки:
5.Охарактеризовать основные компоненты клеточной стенки (КС).
6. Описать основные различия двух типов клеточной стенки.
7. Медицинское значение проведенного анализа?
8. Заполнить таблицу:
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ И ПРОКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ
| Признак | Эукариоты | Прокариоты |
| 1. Хранение генетической информации | ||
| 2. Набор хромосом | ||
| 2. Наличие органелл: - аппарат Гольджи - ЭПС - лизосомы - рибосомы 80 S, место локализации - рибосомы 70 S, место локализации - митохондрии | ||
| 4. Белоксинтезирующая система | ||
| 5. Места синтеза АТФ | ||
| 6. Наличие в клеточной стенке: а) пепдидогликана б) тейхоевых кислот в) ЛПС г) хитина или целлюлозы | ||
| 7. Репродуктивные особенности |
9. Заполнить таблицу:
ОСНОВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ
| Формы бактерий | Рисунок | Морфологические и тинкториальные свойства |
| Стрептококк | ||
| Пневмококк | ||
| Стафилококк | ||
| Менингококк, гонококк | ||
| Кишечная палочка | ||
| Бациллы | ||
| Клостридии |
|
|
|
Подпись преподавателя_________________________________________________________
Теоретическая справка
к работе № 2
Структурные компоненты бактериальной клетки, их функции методы выявления:
| Постоянные компоненты | Функции | Метод выявления |
| Клеточная стенка Гр + (пептидогликан, тейхоевые кислоты) Гр – (ЛПС, пептидогликан, фосфолипиды, белки) | 1) скелетная 2) защитная 3) рецепторная 4) антигенная 5) адгезивная 6) транспортная 7) нарушение синтеза клеточной стенки ведет к образованию L-форм | Световая микроскопия, окраска по Граму |
| ЦПМ (цитоплазматическая мембрана - двойной слой фосфолипидов с внедрёнными белками) | 1) основной осмотический барьер 2) участвует в регуляции роста и синтезе компонентов клеточной стенки 3) транспорт питательных веществ в клетку и метаболитов из нее 4) инвагинации участков ЦПМ - мезосомы - содержат ферменты, обеспечивающие биологическое окисление | Электронная микроскопия |
| Мезосомы - производные ЦПМ | 1) аналог митохондрий, обеспечивают синтез АТФ и процессы дыхания 2) участвуют в делении клетки 3) участвуют в спорообразовании | Электронная микроскопия |
| Цитоплазма - сложная коллоидная система, состоит из воды, растворимых белков | Обеспечивает функционирование всех органелл | Электронная микроскопия |
| Рибосомы – коэффициент седиментации 70S | Отвечают за биосинтез белка | Электронная микроскопия |
| Нуклеоид - двунитевая молекула ДНК, замкнута в кольцо, лишена мембраны | Носитель генетической информации, расположен в центральной зоне бактерий (одна хромосома) | Электронная микроскопия |
| Непостоянные компоненты | Функции | Метод выявления |
| Капсула - слизистая структура, прочно связана с клеточной стенкой (полисахариды или полипептиды) | 1) защитная 2) антигенная 3) адгезивная | Световая микроскопия, окраска по Бурри, Бурри-Гинсу |
| Жгутики состоят из белка-флагеллина, являющимся Н-антигеном Пили – состоят из белка | Обеспечивают движение бактерий Пили 1-го порядка обеспечивают адгезию на поражаемой микробной клетке. Пили 2-го порядка – конъюгационные, обеспечивают перенос части генетического материала от донора к реципиенту | В препаратах «висячая капля», «раздавленная капля», при фазово-контрастной микроскопии Электронная микроскопия |
| Плазмиды - дополнительные факторы наследственности в виде замкнутых колец ДНК с небольшой молекулярной массой | 1) регуляторная – компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина 2) кодирующая – внесение в бактериальную клетку новой генетической информации | Электронная микроскопия |
| Включения - гликоген, полисахариды, бета-оксимасляная кислота, полифосфаты (волютин) и др. | Запас питательных веществ | Световая микроскопия. Волютинвыявляют по Лёффлеру или Нейссеру |
| Спора - плотная многослойная оболочка, с большим содержанием кальция и липидов, низким содержанием воды. Образуют некоторые Гр+ палочки, из одной клетки образуется одна спора. | Сохранение генетической информации, при неблагоприятных условиях. Расположение споры: - субтерминальное - терминальное - центральное | Световая микроскопия, окраска по Ожешко. |
Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска
Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.
1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.
2 этап. Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество материала, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см2.
3 этап. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. В фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.
Методы фиксации
| Физический метод | Химический метод |
| Фиксация мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх | Мазок погружают в фиксатор на определенное время. В качестве фиксатора используют: этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь Никифорова (этанол +эфир – 1:1) – 10-15 мин и др. |
Методы окраски
| Простые методы (ориентировочные) | Сложные методы (дифференцирующие) |
| 1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов. 2. Окрашивают одним красителем анилино-вого ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый. | 1. Применяют для изучения структуры клеток, дифференциации микроорганизмов. 2. Используют несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, НейссераГинса-Бурри и др. |
Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители. Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.
Окраска по Граму. Сущность метода
Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.
У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
Методика окраски по Граму(этапы окраски по Граму представлены на стенде).
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генциановогофиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Препарат промывают водой.
5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
Окраска по Цилю-Нильсену
Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии за счет содержания указанных веществ прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя - метиленового синего – окрашиваются в синий свет.
Методика окраски по Цилю-Нильсену:
1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.
2. Снять бумагу, промыть мазок водой.
3. Нанести 5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до обесцвечивания.
4. Промыть водой.
5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.
6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.
Окраска по Ожешко
Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет.
Методика окраски по Ожешко:
1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.
2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.
Окраска по Романовскому-Гимзе
Методика окраски по Романовскому-Гимзе:
Краска Романовского-Гимзе состоит из метиленового синего, эозина и азура.
3. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.
4. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.
к работе № 3
Техника приготовления препаратов «висячая» и «раздавленная» капли
1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.
2 этап.
| Препарат «раздавленная» капля | Препарат «висячая» капля |
| Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество мате-риала для исследования. Затем на каплю накладывают покровное стекло таким образом, чтобы между ним и предметным стеклом не было пузырьков воздуха. Если культура выращена на жидкой питатель-ной среде, то для приготовления препарата используют пастеровскую пипетку, с помощью которой каплю культуры наносят на предметное стекло. | Препарат готовят аналогичным образом, но каплю культуры наносят на покровное стекло, которое затем накладывают на предметное стекло с лункой, края которой смазаны вазелином. Стекла склеиваются и получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. |
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 405; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!