Принципы действия и конструкции биореакторов

Стр 1 из 3Следующая ⇒

Выделение, концентрирование и очистка биотехнологических продуктов. Седиментация биомассы. Уравнение скорости осаждения. Коагулянты. Флокулянты. Центрифугирование. Выделение из культуральной жидкости клеток высших растений, микроорганизмов. Отделение целевых продуктов, превращенных в твердую фазу.

Выделение продукта из кулыпуральной жидкости

В состав культуральной жидкости входят остатки использованной питательной среды, синтезированные метаболиты и клеточная масса продуцента.

Для выделения биомассы используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры или отстойники. Иногда биомассу осаждают добавлением электролитов, надосадочную жидкость декантируют. После центрифугирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты 75-90% - ной влажности. Клеточную массу промывают, фильтруют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее нужный продукт. Если метаболит находится в растворе, биомассу используют после отделения как побочный продукт, а нужное вещество выделяют из раствора различными методами: фильтрацией, кристаллизацией, осаждением, экстракцией, хроматографией. Антибиотики выделяют, осаждая в виде малорастворимых солей из водного раствора, где они предварительно максимально концентрируются путем экстракции или ионообменным путем, а также высушивая водные растворы лиофилизацией или в сушилках распылительного типа.

Асептика, антиконтаминационная защита в биотехнологии.

Микробиологическое производство принципиально отличается от других тем, что в технических системах присутствуют живые организмы, предъявляющие особые требования к этим системам. Это, прежде всего, комплекс параметров жизнеобеспечения, создание оптимальных условий для развития популяции продуцента, сохранение ее стабильности и продукта, который она синтезирует. Герметизация оборудования, стерильность обеспечивает стандартность и качество микробиологических препаратов.

Контаминанты нарушают нормальный рост и развитие микроорганизмов - непроизводительно расходуется питательная среда, снижается качество целевого продукта. Контроль качества сред необходимо проводить до и после стерилизации.

Для успешного функционирования микробиологического производства необходимо решение двух взаимосвязанных задач: защита технологического процесса от загрязнения контаминантами - посторонней микрофлорой и защита окружающей среды от микроорганизмов, используемых в данном производстве или продуктов их жизнедеятельности.

Классификация биореакторов и расчет их производительности.

Любую систему, у которой существует ограничивающая ее поверхность, и в которой протекают биохимические реакции, можно назвать биореактором.

Промышленный биореактор – это емкость, в которой осуществляются рост микроорганизмов или различные химические превращения.

Промышленные биореакторы могут работать в:

- периодическом режиме;

- периодическом режиме с доливом субстрата;

- полунепрерывном (полупериодическом) режиме;

- непрерывном (проточном) режимах.

Исторически в промышленности утвердился периодический способ работы при осуществлении химических превращений и полунепрерывный – при получении микробной биомассы. В последнее время для химических превращений стали применять реакторы с периодическим режимом и с доливом субстрата, а для получения микробной биомассы реакторы, работающие в непрерывном проточном режиме. Традиционно биореакторы, работающие в непрерывном проточном режиме,, использовались в промышленном масштабе только для аэробной переработки сточных вод и отходов, а также при производстве уксуса.

Детальный анализ некоторых потенциальных режимов работы биореакторов указывает на превосходство проточного непрерывного режима по сравнению с периодическими режимами работы.

При работе по периодическому режиму в реактор загружают все необходимые компоненты, ведут процесс до конца и затем собирают конечный продукт.

Периодический режим с добавлением субстрата предусматривает периодическое или непрерывное введение субстрата без удаления конечного продукта, который собирают только по завершению процесса.

При полунепрерывном ведении процесса, который также называют полупериодическим, по завершении начальной стадии в периодическом режиме наполовину опорожняют, чтобы частично собрать продукт, а затем снова заполняют таким же объемом свежей среды, и доводят процесс до конца; а затем снова осуществляют ту же последовательность операций. Подобный подход направлен на лучшее использование производственной установки.

Сравним производительность реактора, работающего в периодическом и непрерывном проточном, с идеальным перемешиванием, режимах.

Периодический процесс включает несколько этапов:

- подготовительный, начальный период,

- фазу экспоненциального роста,

- период удаления продукта.

Выделяют два типа реакторов непрерывного проточного действия: реакторы с идеальным перемешиванием и проточные биореакторы в режиме полного вытеснения (реакторы поршневого типа).

Биореакторы с идеальным перемешиванием могут работать как хемостаты или как турбидостаты.

Хемостатный и турбидостатный режимы культивирования.

При хемостатном режиме культивирования в биореактор с постоянной контролируемой скоростью вливают питательную среду, один из компонентов которой, чаще всего кислород, поступает в количестве, не достаточном для обеспечения максимальной скорости роста культуры. В этом случае реактор с биообъектом приобретает свойства саморегулирующейся системы, автоматически удовлетворяющей равенству:

m = Д, где

m - удельная скорость роста клеток;

Д – коэффициент разбавления (или скорость уменьшения концентрации клеток).

Если первоначально скорость разбавления и вымывания биомассы превышает скорость роста клеток, то происходит разбавление культуры свежей средой, что ведет к повышению концентрации компонента, ограничивающего рост клеток, вследствие чего скорость роста культуры увеличивается.

Как только m превысит Д, в реакторе начинает концентрироваться биомасса, при этом увеличивающаяся популяция клеток все активнее «выедает» субстрат, следовательно, его концентрация уменьшается, что в свою очередь, ведет к торможению роста культуры.

В конечном итоге, после серии затухающих колебаний скорость роста культуры становится равной скорости разбавления.

Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Он включает:

1) устройство для подачи питательной среды;

2) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости с клетками;

3) систему контроля скорости потока.

Один из простейших вариантов хемостата содержит насос, постоянно нагнетающий питательную среду в биореактор, и выпускную трубу, по которой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается выше горловины этой трубы.

Альтернативный вариант – выпускная труба входит в полость биореактора сверху, и нижний обрез ее горловины соответствует уровню, выше которого жидкость не должна подниматься. Если этот уровень повышен, избыток культуральной среды с клетками отсасывается насосом, подсоединенным к выпускной трубе.

Более точный, но в то же время и более дорогостоящий метод контроля за уровнем жидкости в биореакторе основан на взвешивании ферментера, помещенного на специальную платформу: превышение допустимой массы свидетельствует о подъеме жидкости выше разрешенного уровня, что приводит к автоматическому включению системы откачивания жидкости.

Используют также радиоактивный контроль за уровнем жидкости в биореакторе: изотоп, помещенный на определенной высоте над дном аппарата, испускает радиоактивное излучение, которое в разной степени поглощается водной и воздушной средой. По интенсивности излучения, регистрируемого приемником, судят о высоте подъема жидкости.

В последние годы все большее применение находят фотоэлектронные устройства для контроля уровня жидкости в хемостате.

Турбидостатный режим культивирования основан на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространено измерение светорассеяния содержимого биореактора с помощью фотоэлемента. Сигнал от фотоэлемента управляет скоростью потока жидкости, в свою очередь определяющего скорость роста культуры. Повышение концентрации клеток и соответственно светорассеяния автоматически приводят к ускорению протока жидкости, разбавляющей культуру, и наоборот, убыль биомассы компенсируется замедлением притока.

Концентрация клеток может оцениваться также по косвенным критериям (по измерению рН, убыли субстрата или накоплению продуктов жизнедеятельности).

По своей конструкции турбидостат отличается от хемостата лишь системой контроля скорости потока. Хемостаты и турбидостаты эффективно действуют при различных скоростях разбавления культуры.

Хемостатный режим успешно применяется при малом потоке, когда концентрация клеток меняется незначительно с изменением его скорости, что облегчает саморегулирование системы.

Область функционирования турбидостата – высокие скорости разбавления, при этом происходит быстрое и резкое изменение концентрации биомассы в ответ на изменение скорости протока. Это обеспечивает своевременное срабатывание фотоэлемента или другого датчика, управляющего скоростью протока жидкости через турбидостат. С технической точки зрения турбидостат может быть применен лишь для одноклеточных организмов. При длительном культивировании биообъекта в турбидостате возникает серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу. При засеве смешанной культуры в турбидостате автоматически отбирается наиболее быстрорастущий вид. Это является преимуществом турбидостатного метода, в определенной степени предохраняющим культуру микроорганизма от заражения посторонней микрофлорой. Такой принцип использован для селекции антибиотикоустойчивых организмов.

В промышленности, как правило, применяются реакторы, работающие в режиме хемостата.

Для описания потока в проточном реакторе непрерывного действия удобнее всего использовать распределение частиц, проходящих через реактор, во времени их пребывания в реакторе. В случае проточного реактора полного вытеснения все элементы жидкости проходят через реактор строго упорядоченно, так, что любой данный элемент ни как не перемешивается с элементами, поступающими в реактор до или после него, т.е. отсутствует осевое перемешивание, следовательно, для стационарного состояния проточного реактора с полным вытеснением все порции жидкости, поступающего в реактор, находятся в нем одинаковое время.

Среднее время пребывания:

Τ = , (4)

где V – объем реактора;

F - объемный поток жидкости, поступающий в реактор и вытекающий из него.

Содержимое проточного реактора непрерывного действия с идеальным перемешиванием является полностью однородным, а потому его состав идентичен составу вытекающему из реактора. Питательные вещества, поступающие в реактор, немедленно перемешиваются с его содержимым и находятся в реакторе разное время, но среднее время пребывания для такого реактора определяется тем же соотношением (4).

Уравнение материального баланса для биореактора, работающего в проточном режиме с идеальным перемешиванием без рецикла, т.е. обычного хемостата, где продуктом является только микробная биомасса:

Для микробной биомассы:

Накопление = Рост – Удаление.

Для лимитирующего субстрата:

Накопление = Поступление – Удаление – Использование.

Производительность системы:

Р_н= Дх, где

Х – концентрация микробной биомассы;

Д – скорость разбавления.

Уравнение материального баланса для системы проточного реактора непрерывного действия с полным перемешиванием, единственным продуктом которого является микробная биомасса; в таком реакторе для интенсификации процесса часть концентрированной микробной биомассы используется повторно, поступая из сепаратора, расположенного на выходе из реактора (это может быть седиментационный бак или отстойник; центрифуга или система ультрафильтрации).

Скорость разбавления

Д= F/V, где

F – поток жидкости через систему в целом;

V – постоянный объем жидкости в биореакторе.

Поток выходящий из биореактора:

F_s = F + α*F_s или F_s = F*(1-α), где

Α – доля вытекающего из реактора содержимого, которая используется повторно.

Уравнение материального баланса по биомассе:

Накопление = Рост – Удаление + Повторное использование.

Уравнение материального баланса по лимитирующему субстрату:

Накопление = Поступление + Повторное использование – Удаление – Расходование

Для определения концентрации микробной биомассы в осветленном потоке, вытекающем из сепаратора, нужно найти уравнение материального баланса по биомассе в сепараторе, исходя из предположения, что сепаратор работает в стационарном режиме, т.е. биомасса в нем не накапливается. Тогда уравнение материального баланса будет иметь вид:

Поступление = Повторное использование + Концентрированные отходы + Осветленные отходы.

Если реактор работает в стационарном режиме, то его производительность по биомассе определяется по формуле:

Рп = Д*х*(1-а*ġ)/(1-а)

Рассмотрим работу проточного биореактора, работающего в режиме полного вытеснения. В этом случае в каждом малом элементе жидкости dv, проходящем через биореактор, преобладает в основном экспоненциальный рост (μ=μ_м). Рост биомассы в таком биореакторе без рецикла описывается уравнением:

ln x = lnx₀+μ_m*t,

где х₀- концентрация биомассы в среде, поступающей в биореактор;

х - концентрация в момент времени t;

g – увеличение концентрации биомассы.

Самым лучшим приближением к реактору с полным вытеснением является каскад последовательных реакторов с идеальным перемешиванием без дополнительных поступлений питательных веществ, но для этого число биореакторов, составляющих такой каскад, должно быть бесконечным. Неидеальный поток с полным вытеснением можно получить, лишь, когда работает более 6 последовательных биореакторов.

Принципы действия и конструкции биореакторов.

Биотехнологические процессы принципиально не отличаются от процессов химического синтеза. Для них характерны такие этапы, как загрузка субстратов для реакций синтеза, превращения субстратов, отделение и очистка целевого продукта. Процессы обоих типов могут быть периодическими и непрерывными. Существуют принципы, общие по форме, но различающиеся по практической реализации.

В первую очередь, это принцип масштабирования – поэтапного увеличения объема аппаратов и принцип однородности физико-химических условий – температуры, рН, концентрации растворенных веществ, включая кислород и другие газы, во всем объеме аппарата.

В биотехнологических процессах нередко используют реакторы для химического синтеза, что, однако, порождает серьезные проблемы. Нередко терпят неудачу попытки непосредственно применить в области биотехнологии уравнения для расчета параметров процесса, разработанные для химической технологии. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них принимают участие живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы, что оказывает существенное влияние на процессы массопередачи – обмена веществом между различными фазами (например, перенос кислорода из газовой фазы в жидкую) и теплообмена – перераспределения тепловой энергии между взаимодействующими фазами. Поэтому важной составной частью биореактора является система перемешивания, служащая для обеспечения однородности условий в аппарате, эффективной массопередачи между водной фазой в биореакторе и пузырьками газа или частицами твердого субстрата, между культуральной жидкостью и культивируемыми клетками, а также в пределах жидкости между ее различными слоями.

Расчет системы перемешивания требует ясного понимания особых свойств среды в биореакторе. Клетки, часто соединенные в длинные цепочки, и особенно гифы грибов или актиномицетов значительно увеличивают вязкость среды. Помимо этого, жидкость, содержащая нитевидные образования, как бы приобретает жесткую арматуру. Усилия ниже пороговой величины, приложенные в такой жидкости не вызывает ее перемешивания. Подобные свойства не характерны для жидких сред, не содержащих биообъекта, поэтому в биотехнологии предъявляются особые требования к системе перемешивания, в частности, приходится резко повышать мощность мешалки. Повышение мощности и соответственно ускорение вращения мешалки создают другую проблему. Приложение значительных усилий к жидкости может повлечь за собой угнетение роста биообъекта, снижение эффективности синтеза целевого продукта, повреждение и гибель клеток.

Существенные различия между биотехнологическими и химико-технологическими процессами касаются массопередачи между газовой и жидкой фазами в реакторе. Многие биотехнологические процессы относятся к числу аэробных – они требуют для своего осуществления аэрации, т.е. снабжения кислородом. Для аэрации культуральной среды используют воздух или воздух, обогащенный кислородом, реже чистый кислород. Процессы, протекающие без доступа кислорода (анаэробные), нередко зависят от газообразных субстратов или требуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности.

Системы газоснабжения и газоотведения, важнейшим примером которых служат аэраторы – установки для обеспечения кислородом, должны функционировать эффективно, надежно и в то же время экономично. Технологу приходится балансировать между угрозой перерасхода кислорода, без необходимости пропускаемого через жидкость, уже насыщенную этим газом, и риском исчерпания кислорода в среде, особенно если клетки активно потребляют кислород для дыхания. Кислород плохо растворим в воде; в то же время кислород относится к числу быстро расходуемых газов, и поэтому его запас в жидкости без подпитки исчерпывается за несколько секунд. Все это обуславливает необходимость слаженной работы систем аэрации и перемешивания и постоянного контроля за этими системами. Во многих случаях потребность в кислороде меняется по мере развития культуры. Аэратор должен во время реагировать на эти изменения, увеличивая или уменьшая подачу кислорода. В некоторых производственных процессах концентрацию кислорода в среде поддерживают на уровне, не обеспечивающем максимальное потребление клетками, и тогда необходима точная регулировка скорости его подачи в биореактор.

Фундаментальной характеристикой массопередачи между газом и жидкостью служит объемный коэффициент массопередачи соответствующего газа. Этот коэффициент показывает, какова скорость переноса молекул газа из газовой фазы в жидкую при заданной разности концентраций газа между двумя фазами.

Объемный коэффициент массопередачи зависит от характеристики среды культивирования и аппарата. Он существенно меняется при внесении в среду биообъекта, обычно в сторону увеличения, что объясняется активным поглощением кислорода клетками – это способствует поступлению его новых порций в жидкость из газовой фазы. Увеличение объемного коэффициента массопередачи особенно характерно для разработанных в последние годы биотехнологических процессов, поскольку:

1) применяют концентрированные популяции клеток;

2) широко используется иммобилизация клеток и их компонентов на носителях ведет к активации поглощения кислорода из среды.

Коэффициент массопередачи представляет собой важнейшую характеристику процесса, исходя из которой, проводят расчет, оптимизацию и масштабирование уровня аэрации для культивирования биообъекта.

Оценка этого коэффициента, проводимая по скорости поглощения кислорода с сульфитом (сульфитный метод) или с глюкозой при участии глюкозооксидазы (глюкозооксидазный метод) в отсутствии биообъекта, часто дает ошибочные результаты. Учет влияния растущей популяции клеток на коэффициент массопередачи кислорода, необходимый для корректных инженерно-технических расчетов, достигается с помощью прямых методов регистрации динамики поступления и расхода кислорода, в первую очередь, с использованием кислородных датчиков.

Теплообмен представляет собой также важную составную часть процессов, протекающих в биореакторе, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность биообъекта в существенной мере зависит от температуры. Узкий диапазон температур, оптимальный для биотехнологического процесса, диктуется:

1) резким спадом активности ферментов по мере снижения температуры;

2) необратимой инактивацией (денатурацией) биологических макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) при повышении температуры до определенного уровня.

Температурный оптимум варьирует от организма к организму, от процесса к процессу. Большинство биотехнологических процессов протекает при температурах 30 – 50 °С (мезофильные условия), что имеет свои преимущества, т.к. для поддержания оптимума температуры лишь в редких случаях приходится прибегать к специальному нагреву. Серьезной проблемой, однако, является удаление избыточной теплоты, выделяемой в процессе жизнедеятельности культивируемых клеток, поэтому биореактор должен иметь систему теплообмена.

Расчет и оптимизация системы теплообмена усложняется наличием в биореакторе большого количества контактирующих поверхностей. Теплообмен происходит между клеткой и питательной средой, между средой и стенкой и охлаждающей жидкостью рубашки биореактора, между этой жидкостью и внешней стенкой рубашки, между рубашкой и наружной поверхностью. Система теплообмена должна чутко реагировать на изменение теплопродукции, проходящее в ходе культивирования объекта, поддерживать температуру на постоянном уровне (режим термостатирования) или контролировать ее изменения по заданной программе. Например, на первых этапах роста культуры биореактор прогревают, а далее встает задача отвода избыточной теплоты, выделяемой в процессе жизнедеятельности. Основным параметром процесса теплообмена является коэффициент теплопередачи, который соответствует количеству теплоты, передаваемой в единицу времени через единичную поверхность при разности температур в 1°С.

Увеличить эффективность работы системы теплообмена можно путем:

1) повышения коэффициента теплопередачи;

2) увеличения поверхности теплообмена;

3) увеличения разности температур.

Первые два пути связаны с инженерно-конструкторскими разработками. Коррозия стенок биореактора или их загрязнение снижают коэффициент теплопередачи. Отсюда вытекает необходимость изготовления аппаратов из неподверженных коррозии материалов и его поддержания в чистоте.

Серьезной проблемой для аэрируемых процессов в биотехнологии является вспенивание культуральной среды – образование на ее поверхности слоя из пузырей. Пенообразование связано с наличием в среде поверхностно-активных веществ, к числу которых относятся продукты распада жиров – мыла, а также белки. Белковые вещества содержатся в среде как питательные субстраты (белки соевой, кукурузной муки и т.д.) или представляют собой продукты жизнедеятельности организмов. Как правило, ПАВ включают как полярные, так и неполярные группировки. Заряженные группы имеют сродство к воде и локализуются в водной фазе, а нейтральные выталкиваются из воды в воздушную фазу. Это придает ПАВ ориентацию на границе раздела фаз вода/воздух. Встраиваясь в стенки газовых пузырей, ПАВ значительно удлиняют время их жизни.

Пенный слой поверх среды культивирования в биореакторе имеет двоякое значение. Пена способствует росту многих аэробных микроорганизмов. В пенном слое – «кислородном коктейле» - наибольший прирост дают дрожжи. Внедряясь в границу раздела вода/воздух, пенообразующие ПАВ стимулируют массопередачу между этими фазами, снижая затраты на перемешивание и аэрацию. Нежелательные последствия вызывает избыточное пенообразование. Оно ведет к сокращению полезного объема биореактора, создает угрозу заражения культуры посторонней микрофлорой. Поэтому необходимой составной частью реактора служит система пеногашения.

На практике стремятся вообще не допустить в биореактор постороннюю микрофлору, создав в нем соответствующие условия. Система стерилизации представляет собой специфический элемент биореактора, не имеющий аналогов в аппаратах химической технологии. Устранение посторонней микрофлоры из реактора до введения в него штамма продуцента, поддержание чистоты культуры на всем протяжении биотехнологического процесса, надежная стерилизация питательных сред, добавочных компонентов, пеногасителей, воздуха, подаваемого в биореактор – все это рассматривается как принцип асептики биотехнологического производства.

Все более широкое применение в биотехнологии находит принцип дифференцированных режимов культивирования: разные этапы одного процесса целесообразно осуществлять при различных условиях, варьируя такие параметры, как температура, рН среды и т.д.

Нередко к повышению эффективности биотехнологического процесса ведет разобщение роста культуры и синтез целевого продукта. Показательный пример – технологический способ стабилизации генно-инженерных мутантов. Полученные путем плазмидного переноса сверхпродуценты тех или иных соединений, как правило, отстают в росте от представителей дикого типа, более экономно расходующих материальные и энергетические ресурсы клетки. Чтобы избежать вытеснение сверхпродуцента диким штаммом, плазмиду, отвечающую за сверхпродукцию, ставят под контроль термолабильного репрессора. Генно-инженерный штамм выращивают при пониженной температуре, при которой репрессор подавляет синтез целевого продукта. Плазмидный штамм не расходует материал на его синтез и растет с нормальной скоростью. После накопления достаточного количества клеток в биореакторе температуру повышают до уровня, при котором наступает инактивация репрессора, и вся масса клеток с активно функционирующими плазмидами «выстреливает» целевой продукт.

Таким образом, в согласии с основными принципами реализации биотехнологических процессов современный биореактор должен обладать системами:

1) эффективного перемешивания и гомогенизации питательной среды;

2) обеспечения доступа и быстрой диффузии газообразных агентов (наиболее часто речь идет о системе аэрации среды);

3) теплообмена, отвечающего за поддержание температуры внутреннего объема биореактора и (или) за ее контролируемые изменения;

4) пеногашения;

5) стерилизации сред, аппаратуры и воздуха;

6) контроля и регулировки процесса.

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 2892; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 3 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!