Микрокапсулирование ферментов как один из способов их иммобилизации. Размеры и состав оболочки микрокапсул

Понятие вектора в генетической инженерии. Векторные молекулы на основе плазмидной и фаговой ДНК. Химический синтез фрагментов ДНК. Методы секвенирования генома. Химический синтез гена.

 

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИООБЪЕКТА МЕТОДАМИ КЛЕТОЧНОЙ

ИНЖЕНЕРИИ .

С химической точки зрения ДНК всех организмов идентичны и поэтому

генная инженерия открывает возможность для перемещения генов в пределах

всех живых организмов.

Техника генной инженерии включает:

-получение индивидуальных фрагментов ДНК из генома организма

-определение последовательности оснований, т.е. определение строения генов.

На генетическом уровне жизнь универсальна (т.е. во всех живых организмах

носители наследственности являются, как правило, ДНК).

Молекула АТФ является переносчиком энергии во всех живых организмах, с

помощью АТФ образуются белки, состоящие из 20 аминокислот.

Воспроизведение микромолекул в живых системах также подчиняется

основным принципам:

1. репликация (удвоение ДНК)

2. транскрипция (матричный синтез РНК, матрица –ДНК)

3. трансляция (синтез белка)

Во всех процессах главным является правильная последовательность

нуклеотидов матрицы.

Область действия генного инженера (фрагмент ДНК) называется сайтом.

Для генного инженера необходим:

- чтобы гибридная молекула стабильно удваивалась,

- исследовать матричный синтез после введения гена чужеродного белка,

- чтобы чужеродный белок синтезировался

Таким образом, для генного инженера важно, чтобы молекула ДНК

чужеродного белка работала (экспрессировалась).

Техника генноинженерного эксперимента (стадии)

1. Получение ДНК чужеродного фрагмента, который необходимо включить

(вклеить) в клетку хозяина. Например, получение ДНК человеческого

инсулина.

 

Рис.12.

2. Получение плазмиды из клетки донора

Есть клетка-реципиет (напр. Е. coli ) из которой мы получаем плазмиды (

это элементарная концевая молекула ДНК в 100-1000 раз меньше хромосомы,

существует в бактериальных клетках или клетках прокариот, плазмиды несут

ограниченное количество генов ( не более 30 ).

 

 

Рис.13.

3. Конструирование рекомбинантной плазмиды ( вектора)

Вектор – рекомбинат ( подготовленная для генно-инженерных манипуляций

плазмида или в виде фага или в виде изолированной ДНК или вируса) или

часть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает проникновение и

дальнейшую репликацию этой ДНК в клетке хозяина.

Вектор получают с помощью рестриктазы ( разрывает фосфодиэфирные связи в

строго определенном месте последовательности оснований нуклнеотидной

цепи)

 

Рис.14.

Генному инженеру необходимо для получения рекомбинанта использовать

Ecor I, т.к. деятельность BSUR I менее выгодно ( шести-частотная

последовательность встречается через каждые 44096 раз; четырех частотная

последовательность встречается через каждые 250 раз; при более частой

последовательности можно изрезать нужный ген ).

Введение фрагмента ДНК (гена человеческого инсулина в плазмиду клетки

реципиента (E.coli) : 2 липких конца одного биообъкета и 2 липких конца

другого комплементарно воссоединились. Ген инсулина является чужеродным,

поэтому может иметь место такое явление как отжиг.

Рис.15.

 

Отжиг– это процесс смещения двух фрагментов ДНК, когджа

восстанавливаются только водородные связи и фосфодиэфирные связи не

образуются.

Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ДНК-лигазы – это

ферменты, которые восстанавливают ковалентные фосфодиэфирные связи и

таким образом концы однотяжевой линейной молекулы ДНК соединяются с

кольцевой молекулой ДНК- плазмидой. Плазмида – это вектор. Так лиганды

сшивают, склеивают молекулы ДНК. На этом этапе плазмида называется

вектором или транскриптом.

4. Включение вектора в клетку-реципиент (Е.coli)

Условием включения вектора в клетку реципиента является то, что

цитоплазматическая мембрана ее должна близко подходить к клеточной стенке,

когда вектор входит внутрь клетки через окошечки.

5. Отбор гибридных клонов

Рис. 16.

Посев идет на питательную среду, содержащую, как пример,

бензилпенициллин, при этом вырастают клоны клетки Е.coli с маркером в

гибридной плазмиде.

Рис. 17

 

У эукариот при образовании молекулы м РНК имеет место процесс

сплайсинга (от английского splicing- созревание, сращивание). Ген у эукариот

представляется не непрерывный, а мозаичной структуры, содержащей наряду с

кодирующими, несущими информацию (так называемые экзоны), также

некодирующие, не несущие информацию (интроны) последовательности.

Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза катализирует транскрипцию как

экзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга интроны с помощью

ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интронов сращиваются. При

этом образуется функционирующая м РНК.

У прокариот процесс образования м РНК идет проще. При помощи РНК-

полимеразы идет транскрипция соответствующего гена. Процесс сплайсинга у

прокариот отсутствует. Образующаяся в процессе транскрипции молекула м

РНК уже способна к функционированию.

 

Рис.18.

 

Техника безопасности при работе с генно-инженерными штаммами

1. Генно-инженерный штамм должен быть дефектным, то есть

ауксотрофом (с включенным маркером, без которого он не может

существовать).

2. Физические предупреждения, когда в процессе ферментации создается

отрицательное давление в ферментере и в случае выброса выходят только

небольшие количества микроорганизмов, которые погибают, являясь

ауксотрофами (требуют хорошей питательной среды).

Генно-инженерные штаммы являются нестойкими образованиями.

 

Микрокапсулирование ферментов как один из способов их иммобилизации. Размеры и состав оболочки микрокапсул.

 

Ферменты (Ф) - белковые вещества, выполняющие функции ката­лизаторов химических реакций и используемые в медицине, пищевой, фармацевтической и химической промышленности. Реакции, осуществ­ляемые ферментами, не требуют экстремальных условий (температуры, кислотности среды и др.)> оптимальное значение температуры для большинства Ф 20-40 °С, ее повышение до 40 °С и выше, как правило, влечёт снижение активности Ф или их полную денатурацию. Ферменты характеризуют высокая скорость, стереоспецифичность, и незначитель­ное количество образующихся побочных продуктов. Важное их свойст­во - эффективность катализа (ферменты увеличивают скорость в 10¹⁰-10¹² раз) и избирательность действия (каждый фермент, как правило, ка­тализирует одну химическую реакцию). Ферменты способны катализи­ровать не только расщепление, но и образование химической связи.

Ферменты - высокомолекулярные соединения с м.м. от 10000 до 1000000. Ферментные белки малоустойчивы, весьма чувствительны к изменениям рН и температуры. Для каждого Ф существует оптимум значения рН, при котором скорость катализируемой реакции макси­мальна; отклонения значения рН в ту или иную сторону ведут к сниже­нию скорости ферментативной реакции.

Иммобилизация Ф микрокапсулированием. Основное при этом виде иммобилизации - удержание раствора, окружающего Ф. Иммоби­лизуется целиком исходный раствор, содержащий Ф, а не отдельные молекулы Ф. Преимущество микрокапсулирования — большая площадь поверхности, приходящаяся на единицу активности иммобилизованного Ф, позволяющая использовать высокие концентрации Ф в исходном растворе и достигать большей эффективности действия иммобилизо­ванного Ф. Размер микрокапсул составляет десятки или сотни микрон.

Для предотвращения Ф от инактивации с органическими раствори­телями и мономерами перед микрокапсулированием Ф смешивают с полимерами, способствующими сохранению его активности — бычьим сывороточным альбумином, гемоглобином, ПВП, ПВС, ПЭГ в концен-

трации 1%. Гидрофобные участки полимеров экранируют молекулу Ф, защищая её в процессе микрокапсулирования.

Для образования микросфер в органическом растворителе исполь­зуют эмульгатор (span-85 в концентрации 0,1%) для покрытия поверх­ностей капелек водной фазы, что предохраняет Ф от непосредственного контакта с органическим растворителем.

Физические и химические свойства микрокапсулированных Ф зави­сят от природы полимера, из которого формируется микрокапсула. По­лимер должен обладать когезионными свойствами, обеспечивающими образование непрерывной плёнки, быть проницаем для субстрата, инертным по отношению к реакционной смеси. Для получения микро­капсул используют природные и синтетические полимеры - карбокси-метилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозу, нитрат целлюлозы, желатин, эпоксидные смолы, полиуретаны, стирол, полиамиды.

Для микрокапсулирования ферментных систем чаще всего исполь­зуют коацервацию. Полимерами для коацервации являются - ацетат и нитрат целлюлозы, бутадиеновый каучук.

Микрокапсулирование включает следующие стадии:

1) Растворение Ф в буферном растворе, содержащем для защиты Ф от денатурации другие белки, например альбумин.

2) Приготовление органической фазы, содержащей эмульгирую­щий агент, например, span-85. Органическая фаза не должна смешиваться с водой; обычно это эфир, циклогексан, толуол.

3) Внесение водного раствора Ф в органическую фазу, перемеши­вание в течение заданного времени с определённой скоростью; от скорости перемешивания зависит размер микрокапсул.

4) Добавление к двухфазной смеси второго органического раство­ра, содержащего полимер и органический растворитель (пере­численные на второй стадии). При добавлении второго органи­ческого раствора происходит образование мелкого коллоида, обусловленное разбавлением органического растворителя.

5) Не прекращая перемешивания в условиях вакуума (до 25 мм рт. ст.), отгоняют органический растворитель, при этом происходит дальнейшее осаждение водных микросфер с плотной мембра­ной. Толщина мембраны зависит от количества полимера, до­бавленного к органической фазе и времени преципитации.

6) Выделение микрокапсул из органической фазы центрифугиро­ванием и промывка буферным раствором, содержащим твин-20.

 

3. Витамин В₂ (рибофлавин). Основные продуценты. Схема биосинтеза и пути интенсификации процесса.

 

Биосинтез витаминов. Витамины, химический синтез которых невозможен в крупномасштабном производстве или нецелесообразен, получают с применением микроорганизмов, способных к сверх-синтезу и накоплению определенных витаминов.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов - продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них, создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Наиболее целесообразно таким путем производить особо сложные по строению витамины: В₂, В₁₂, b - каротин (провитамин А) и предшественники витамина Д. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Получение микробиологическим способом витамина В₂ (рибофлавин)

До 30-годов прошлого столетия В₂ выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени - 6 г.

В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина - гриб Eremotheciumashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В₂.

Технологический процесс производства витамина  В₂

Состоит из трех основных стадий:

Аэробная ферментация.

Термолиз и концентрирование.

Сушка, размол, гранулирование и упаковка.

 

Посевной материал и стерильный воздух получают по схеме, типовой для многих микробиологических производств. Основными ингредиентами питательной среды является соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, хлорид натрия, технический жир, витамины, карбонат кальция. Процесс ферментации осуществляется в типовых ферментаторах объемом 63-100 м³ в стерильных условиях при температуре 28-30 °С. Время культивирования 60-80 ч. до начала лизиса клеток и образования спор. При этом содержание рибофлавина в культуральной жидкости достигает 1200 мг/л.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость вместе с мицелием передают в вакуум-выпарные аппараты, где ее нагревают до 80 ° с целью разрушения (термолиза) клеточных структур и одновременно ведут процесс концентрирования (упаривания) до содержания сухих веществ 30-40%.

Полученный после упаривания концентрат в виде сиропообразной биомассы высушивают в распылительной сушилке типа «Ангидро» до содержания влаги не более 8%. В результате получают смесь биомассы мицелия E.Ashbyii и сухих остатков питательной среды.

Для получения однородного товарного продукта смесь размалывают и просеивают. На современных предприятиях концентрат далее гранулируют и упаковывают. В 1983 г. во ВНИИ генетики микроорганизмов сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillussubtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез В₂. Полученный штамм продуцент Витамина В₂ способен синтезировать втрое больше по сравнению с Eremotheciumashbyii количества В₂ всего за 40 ч. ферментации.

 

---

Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 957; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!