ПОДГОТОВКА ИЗУЧАЕМОГО МАТЕРИАЛА
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Сибирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России)
Кафедра физической культуры и здоровья
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
На тему: «Методики приготовления гистологических препаратов»
По дисциплине морфология в разделе гистологии
Выполнил:
студент 1 курса
медико-биологического факультета
группы № 4701
Калашников Федор
Евгеньевич
Проверил:
Щаденко
Сергей Владиморович
Томск 2018
Содержание:
0. Введение……………………………………………………………………….3
1. Подготовка рабочей зоны, инструментов и оборудования………………....4
2. Подготовка изучаемого материала:
2.1. Цикл промывки и обезвоживания гистологическому материала...5 Заливка………………………………………………………….………8
2.2. Создание оптимальной геометрии гистологического материала….10
2.3. Окрашивание гистологических срезов……………………………....11
2.4. Приготовление цепочки гистологических срезов…………………..12
3. Выводы……………………………………………………………………….13
4. Список литературы………………………………………………….……….14
ВВЕДЕНИЕ
Выведение методик приготовления гистологических препаратов было обусловлено невозможностью изучать средствами микроскопии не подготовленных объектов исследования, по причине специфики устройства световых микроскопов1.
|
|
|
Операциям обработки материала предшествует подготовка рабочего помещения и оборудования2:
1) создание определённой чистоты помещения;
2) создание микроклимата помещения;
3) проверка исправности и калибровка оборудования;
4) подготовка рабочего места;
Материал для микроскопического исследования требуется2:
1) обезводить, по причине:
а) растворения водой многих используемых красителей-маркеров;
б) не подходящей плотности воды, при работе при комнатной температуре.
2) заполнить, освободившееся пространство подходящим по показателям материалом, с требуемой плотностью и светопроницаемостью, необходимыми при нарезке и рассмотрении--уплотнение
3) создать геометрию материала, оптимальную для дальнейшей обработки;
4) создать цепочку гистологических срезов с помощью микротома;
5) окрасить, с целью выделения изучаемых структур из общей площади среза;
6) зафиксировать в неизменном положении;
7) хранить до востребования.
Комплекс вышеперечисленных условий и процедур, играет ведущую роль в корректности изучения гистологических материалов и снижении процента ложных данных на этапах получения результатов.
|
|
|
1-Rawitz, R. Leitfadenfuerhistologischen / R.Rawitz. - Jena : [s. n.], 1889.2- Наглядная гистология (общая и частная) : учебное пособие для студентов медицинских вузов / Л. Г. Гарстукова, С. Л. Кузнецов, В. Г. Деревянко. - М. : МИА, 2008. - 204 с. - ISBN 5-89481-597-5
ПОДГОТОВКА РАБОЧЕЙ ЗОНЫ, ИНСТРУМЕНТОВ И ОБОРУДОВАНИЯ
Рабочая зона должна находиться в гистологической лаборатории, в типовом или специальном помещении. Готовность рабочей зоны ко всем этапам создания гистологических срезов – ведущая необходимость. Загрязнённость помещения и недостаток оборудования или инструментов существенно снижают точность проводимых исследования, чистоту гистологических препаратов. Повышается риск создания «артефактов», структур, образованных в следствии обработки материала гистологического исследования, нежелательных в постановке реалистичной картины изучения тканей, клеток, постклеточных структур, межклеточного вещества, внутриклеточных структур.
Рекомендуется следующий состав воздуха1:
| Вещество | мг/м3(max) | мг/м3(min) |
| Пыль нетоксичная | 0,50 | 0,15 |
| Анилин | 0,05 | 0,03 |
| Ацетон | 0,35 | 0,35 |
| Бензин | 5,00 | 1,50 |
| Бензол | 0,30 | 0,10 |
| Двуокись азота | 0,85 | 0,04 |
| Дихлорэтан | 3,00 | 0,10 |
| Окись углерода | 5,00 | 3,00 |
| Ртуть | - | 0,0003 |
| Свинец | 0,001 | 0,0003 |
| Сернистый ангидрид | 0,50 | 0,05 |
| Сероводород | 0,008 | - |
| Сероуглерод | 0,03 | 0,005 |
| Фтористый водород | 0,02 | 0,005 |
| Хлор | 0,10 | 0,03 |
|
|
|
Инструменты и рабочие поверхности не должны быть загрязнены после прошлой работы.
Оборудование должно быть сертифицировано, при начале работы с микротомом обязательно изучение инструкции, установление, сначала, заводских показателей, затем требуемых для конкретной работы. Одноразовые детали требуется заменить, при не имении сменных, удостоверится в соответствии с параметрами рабочих состояний установленных деталей2.
С момента создания первых статей по гистологической технике Р. Равицем3 в 1889 году разительно изменился подход к подготовке помещения, оборудования и инструментов, принципиально выполнявших ту же функцию, что и сейчас. По причине развития точности аппаратуры. Эту разницу к подходам и удаётся пронаблюдать, сравнив два пособия.
2.-Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова—М.:Медицина, 1996.—544с.:ил.ISBN 5-225-02820-9; 3-Mikrotom Dreh 3003 Bedienungsanleitung/unter der Aufsicht von H. Were; 4-Rawitz, R.LeitfadenfuerhistologischenUntersuchungen.
|
|
|
ПОДГОТОВКА ИЗУЧАЕМОГО МАТЕРИАЛА
ЦИКЛ ПРОМЫВКИ И ОБЕЗВОЖИВАНИЯ МАТЕРИАЛА.
Удаление воды из гистологического материала важно для последующих этапов обработки. Эта процедура несёт характер консервирования, подготовки материала к заливке, которая в свою очередь придаёт материалу требуемые характеристики. Значимо, что первые гистологические материалы, за не имением технологии, подготавливались путём заморозки, но это мешало их дальнейшей нарезке, препятствовало изучению. Стоит добавить, в наши дни гистологический материал, который необходимо обработать незамедлительно, для иммуногистохимического исследования, готовят путём заморозки и нарезают в креостате. Качество таких срезов ниже, они несут больше медицинское значение, диагностическое, нежели научное.
Для обезвоживания научных гистологических материалов предлагаются спирты, часто абсолютизированный изопропанол, со следующими показателями и концентрациями при приготовлении:
| Получение 100 мл спирта | Взять, мл | |||||||
| 96% спирт | Н2О дист. | 90% спирт | Н2О дист. | 80% спирт | Н2О дист. | 70% спирт | Н2О дист. | |
| 40% | 42 | 58 | 44 | 56 | 50 | 50 | 57 | 43 |
| 45% | 47 | 53 | 50 | 50 | 56 | 44 | 64 | 36 |
| 50% | 52 | 48 | 56 | 44 | 63 | 37 | 71 | 29 |
| 60% | 63 | 37 | 67 | 33 | 75 | 25 | 86 | 14 |
| 70% | 73 | 27 | 78 | 22 | 88 | 12 | -- | -- |
| 80% | 83 | 17 | 89 | 11 | -- | -- | -- | -- |
| 90% | 94 | 6 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
Методики обезвоживания гистологического материала специфичны для каждого исследования, отклонение от стандарта не будет считаться грубой ошибкой в проведении гистологического исследования, если в ходе него были
5-Быков В. Л. Цитология и общая гистология. — СПб.: СОТИС, 2002, стр. 16
скомпенсированы факторы влияния окружающей среды, недостатки доступного оборудования, нехватка человеческого ресурса, человеческий фактор5.
Современная гистология имеет тенденцию к минимализации вмешательства человека в технологический процесс, но внесение оперативных изменений, связанных с глубоким понимание последовательных физико-химических процессов, визуальной оценки, может дать больший коэффициент полезности по отношению к состоянию гистологического материала, чем сугубо последовательно, запрограммированное выполнение действий специальным оборудованием, даже при наличии в нём датчиков наблюдения6.
Основной предлагается методика обезвоживания гистологического материала, с помощью ручной проводки,в спиртах, с нижеизложенными этапами7:
Этап №1
| Температура | Размеры материала | Порядок и концентрация спирта | Время | |
|
Т=296К t=23 |
1-2 x 1-1,5 x 0,5-0,8 см | 80% | 18-24ч. | |
| 96%( | ) | 18-24ч. | |||
| 96%( || ) | 18-24ч. | |||
| ~100% | 6-24ч. | |||
Этап №2
| Температура | Размеры материала | Порядок и концентрация спирта | Время | |
|
Т=296К t=23 |
1-2 x 1-1,5 x 0,5-0,8 см | 80% | 18-24ч. | |
| 96%( | ) | 18-24ч. | |||
| 96%( || ) | 18-24ч. | |||
| 96%( ) | 6-24ч. | |||
| Температура | Размеры материала | Порядок и концентрация спирта | Время | |
|
Т=296К t=23 |
1-2 x 1-1,5 x 0,5-0,8 см | 80% | 18-24ч. | |
| 96%( | ) | 18-24ч. | |||
| 96%( || ) | 18-24ч. | |||
| метилбензоат-этанол 96% | 2-4ч. | |||
| метилбензоат-этанол 96% | 12-24ч. | |||
Этап №3
Логично, что при таком подходе уменьшение размера материала пропорционально качеству обезвоживания. В действительности, ручное соблюдение графиков смены раствора приводит к сбою режима сна по причине надобности просыпаться в ночное время.
Затем следует этап заливки гистологического материала раствором, который при затвердевании обеспечит подходящую плотность, жёсткость, прочность. Заливки соответствуют принципу микроскопирования. В «классическом» гистологическом научном исследовании низкой степени стоимости применяется парафин, в случает оптической микроскопии. Парафин обеспечивает характеристики для нарезки материала в пределах 4-5 мкм.
В трансмиссионной и сканирующей микроскопии применяются синтетические полимерные заливки с диффузным, химическим, волновым инициатором затвердевания. С вступление в эру доступной электронной микроскопии количество заливок выросло, пропорционально их доступности.
6-Учебно-методическое пособие для самостоятельных занятий по общему курсу гистологии : методическое пособие / Сибирский медицинский университет (Томск) ; сост.: С. В. Логвинов, А. И. Рыжов, А. В. Герасимов. - Томск : б. и., (на обл. год вып. 1997) 1995 .7- «О месте и значимости традиционных и инновационных методов реализации принципа наглядности в процессе обучения студентов на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии медицинских вузов» / А. А. Стадников/611.01
ЗАЛИВКА
Известно, заливочный материал выбирается исходя их его физических свойств.
Подбираются показатели твёрдости, плотности, светопроницаемости, электронопрозрачности.
Выделяются основные методики заливки в различные среды:
| По Меркулову | По Волковой-Елецкому | |
| Заливка в парафин: | 1.Спирт+хлороформ(1:1) 6-12ч или спнрт+ксилол(1:1) 1-3ч или хлороформ 6-12ч или ксилол 1-6ч 2.хлороформ+парафин (1:1—«каша») 37°С 2-3ч или ксилол+парафин (1:1 — «каша») 37°С 1-2ч 3.napaфин I 56 °С 2ч 4.парафин II 56 °С 1ч | 1.спирт 100 % + хлороформ(1:1) 2-3ч 2.хлороформ I 1,5ч 3.хлороформ II 0,5ч хлороформ III 0,5ч 4.хлороформ+парафин (1:1) 37°С 3-6ч 5.хлороформ+парафин (1:1) 56°С 0,5-1ч 6.парафин I 56°С 2ч 7.парафин II 56°С 2ч 8.парафин III 56°С 1ч |
Стоит упомянуть, что для заливки для электронного микроскопирования применяют «Целлоидин по Ромейсу», схема практична, доступна, экономически рентабельна. Выполняется в следующей технологической последовательности:
| СХЕМА ЗАЛИВКИ ЦЕЛЛОИДИНОМ ПО РОМЕЙСУ | |
| ЗАЛИВКА В ЦЕЛЛОИДИН | 1.Спирт-эфир(1:1) 4 – 6 ч 2.Целлоидин 2% 2 д 3.Целлоидин 4% 2 д 4.Целлоидин 8% 8 д 5.Целлоидин 16% уплотнение в фиксаторе до образования поверхностной корочки в парах хлороформа. 6.Спирт 70% хранение |
Среди специфичных заливок стоит выделить заливку в желатин (для исследования липидов в рыхлых тканях и органах, а также при изучении эмбриональных объектов с успехом применяют заливку в водорастворимый биополимер желатин) «по Гескеллю-Граффу», в полиэтиленгликоль (для целей гистохимии, особенно для выявления липидов и ферментов) «по Ринерхарту-АбдульХею», в поливакс (та же причина, что и в предыдущем случае) «по Стидмену».
| Заливка в полиэтиленгликоль различной молекулярной массы по Ринерхарту—Абуль-Хею | Заливка в поливакс по Стидмену | Заливка в метилметакрилат по Хиршу—Болларду |
| · Формалин5% 24-48ч · Промывание в проточной воде 12ч · Полиэтиленгликоль-400 + дистиллированная вода (1:1) 30м · Полиэтиленгликоль-400 + дистиллированная вода (3:1) 30м · Полиэтиленгликоль-400 30м · Полиэтиленгликоль-1000 40"С 30 м · Заливка смесью полиэтиленгликоль-1550 + полиэтиленгликоль-4000 (1:9) при 58 "С 30 м | Формалин 5 % 6—24 ч Промывание в проточной воде6— 12ч Обезвоживание в 70 % и 96 % спиртах 24 ч Спирт 96 % + поливакс (1:1) 2ч Поливакс 40"С Зч Свежая порция поливакса при 40 "С 3 ч Заливка в поливакс при 40 "С Застывание блоков при комнатной температуре | Формалин 5 % 6— 12 ч Промывание в 70 % спирте 10 м Споласкивание в 96 % спирте 2 м Спирт 96 % 2ч Метилметакрилат 2 ч Смесь (А+Б+В+Г) при 50 "С 2ч Свежая порция этой смеси при 50 -60 "С 6 - 10ч Затем материал выдерживают при комнатной температуре в течение 1 суток |
ПРИДАНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ ГЕОМЕТРИИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОМУ МАТЕРИАЛА
Однозначного мнения в данном вопросе не сложилось. Гистологи, по большей части, опираются на эмпирический опыт. Придание гистологическому материалу формы, после заливки и затвердевания, осуществляется механической обработкой. После чего блок фиксируется на прочном основании, для дальнейшего зажатия в держатель (на многих видах микротомов им выступает струбцина)
При работе с готовыми блоками складывается мнение, что залитый гистологический материал должен обладать формой усечённой четырёхугольной пирамиды, с параллельными основаниями, где угол боковых плоскостей и основания принадлежит диапазону от восьмидесяти до девяноста градусов, не включительно. Таким образом материал оказывается прикреплён к основанию с возросшей надёжностью, в сравнении с кубическим материалом. Нижняя часть блока, если его заведомо довести до температуры резки, нагревается или охлаждается медленней, чем верхняя, в этом случае минимизируется разность температур в нарезаемых частях во время создания цепочки срезов. Отсутствие надобности перемещать блок ведёт к повышению качества среза.
ОКРАШИВАНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.
Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.
В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители.
Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др.
Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий. Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань.
Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня. Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым.
Окрашивание одним красителем - простое, а при использовании нескольких красителей — сложное.
Микроскопическая техника: Руководство / Под редакцией Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова. — М.: Медицина, 1996.
| НАБЛЮДАЕМЫЕ ДАННЫЕ | ВОЗМОЖНАЯ ПРИЧИНА | УСТРАНЕНИЕ |
| Крошится парафин | Слишком твёрдый материал. Медленно охлаждался при заливке Низкая температура окружающей среды Большой угол наклона ножа | Подышать на блок Изменить угол наклона ножа Перезалить объект |
| Ткань отделяется от парафина | Заливка проводилась холодным парафином Плохая пропитка материала При проводке остались следы спирта | Перезалить блок, предварительно поместив его в промежуточную среду для удаления спирта |
| Материал плохо режется ткань белесоватого цвета срезы сморщенные, плохо расправляются | Недостаточное обезвоживание ткани | Блок расплавляют в термостате и пропускают по батарее в обратном порядке до 100% спирта, затем снова заливают по схеме. |
| Нож «подскакивает», не срезая ткань или на срезах образуются поперечные борозды | Переуплотнение или пересушивание материала при фиксации или обезвоживании | Резать материал, поместив на него кусочек льда Взять из архива новый и провести по схеме |
| Срезы сморщенные, прилипают к поверхности ножа, закручиваются | Недостаточный угол наклона ножа Высокая температура в помещении Материал залит в легкоплавный парафин | Изменить угол наклона ножа Перед срезами материал поместить в холодильник Перезалить в более тугоплавкий парафин |
| Срезы покрыты полосами и легко раскрываются | Плохое качество ножа: зазубрины Загрязнение парафина: плотные соринки Наличие в ткани солей кальция | Сменить или передвинуть нож Декальцинировать Использовать специаль-ныеножи(для керамики, синтетики, плотных тканей) |
| Срез прилипает к ножу | электризация | Подышать на блок |
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЦЕПОЧКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Перед нарезанием блока гистологического препарата обязательно ознакомление с инструкцией микротома, возможными проблемами, которые могут привести в повреждению блока и/или микротома (указаны данные при заливке парафином, наиболее часто применима)
ВЫВОДЫ
Гистология 21го движется размеренными шагами.
Методики меняются, исходя из возможностей лабораторий, иногда, не в сторону повышения качества. В основах методик прослеживается филогенетическая связь между поколениями гистологических исследований.
Главным остаётся людской ресурс, кропотливая, многолетняя работа. Множество статей публикуются для узкого круга лиц в силу специфичности информации, изложенной в них.
В данном обзоре были рассмотрены общие методы, без внедрения в глубокие процессы.
Были использованы типичные для разбора методов приготовления гистологических препаратов литературные источники.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ГОСТ 7.1-2003
1. Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова—М.:Медицина, 1996.—544с.:ил.
2. Наглядная гистология (общая и частная) : учебное пособие для студентов медицинских вузов / Л. Г. Гарстукова, С. Л. Кузнецов, В. Г. Деревянко. - М. : МИА, 2008. - 204 с.
3. Быков В. Л. Цитология и общая гистология. — СПб.: СОТИС, 2002, стр. 16
4. Учебно-методическое пособие для самостоятельных занятий по общему курсу гистологии : методическое пособие / Сибирский медицинский университет (Томск) ; сост.: С. В. Логвинов, А. И. Рыжов, А. В. Герасимов. - Томск : б. и., (на обл. год вып. 1997) 1995
5. Микроскопическая техника/ Ромейс Б. М.: Издательство иностранной литературы, 1953. — 119 с
6. Общая морфология организмов/ Геккель Э., 1866
7. Курс патологогистологической техники/ Меркулов Г.А.Четвёртое изданиеЛ.: "МЕДГИ3", 1961. - 343 с.
8. - «О месте и значимости традиционных и инновационных методов реализации принципа наглядности в процессе обучения студентов на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии медицинских вузов» / А. А. Стадников/611.01
9. Rawitz, R. LeitfadenfuerhistologischenUntersuchungen/ 1889.
10. MikrotomDreh 3003 Bedienungsanleitung/ unter der Aufsicht von H. Were/2015
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 200; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!