Цитогенетичний метод, його значення
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ВІННИЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені М.І. ПИРОГОВА
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ СТУДЕНТІВ
ПРИ ПІДГОТОВЦІ ДО ПРАКТИЧНОГО (СЕМІНАРСЬКОГО) ЗАНЯТТЯ
| Навчальна дисципліна | Медична генетика |
| Модуль № | 1 |
| Змістовий модуль № | 2 |
| Тема заняття №2 | Клініко-генеалогічний метод. Цитогенетичні і молекулярно-генетичний методи. Біохімічні методи. |
| Курс | 5 |
| Факультет | медичний |
1. Актуальність теми:
Із покрашенням уяви лікарів про спадкові і вродженні захворювання необхідно покращити знання з специфічних генетичних методів діагностики.
Серед генетичних методів діагностики виділяють наступні:
· клініко-генеалогічний метод
· цитогенетичні методи
· молекулярно-генетичний методи
· біохімічні методи
Клініко-генеалогічний метод в клінічній практиці використовують для з'ясування природи захворювання, оцінки клінічних проявів, диференціальної діагностики спадкових форм патології, вивчення генетичної гетерогенності захворювань, оцінки ризику виникнення нових випадків захворювань у родині ,що важливо для прогнозу хвороби та життя членів родини.
Для цього необхідно знати критерії різних типів спадкування (аутосомно-домiнантнoго, аутосомно-рецесивного, Х-зчепленого домінантного, Х-зчепленого рецесивного, голандричного, мiтохондрiального), характер родоводів, співвідношення статей, сегрегацю патологічних ознак у родинах, залежність характеру родоводу від частоти генів у популяції.
|
|
|
Галузь застосування цитогенетичних методів має велике значення для діагностики хромосомної спадкової патології, вивчення мутаційного процесу, дослідження нормального поліморфізму хромосом.
Значення біохімічних методів у діагностиці спадкових хвороб обміну є важливим, так як відомо понад 1000 спадкових захворювань обумовлених дефектами обміну речовин. Рівні біохімічної діагностики дозволяють встановити первинний продукт гена, клітинний рівень порушення, виявити метаболіти в біологічних рідинах для діагностики та контрлю за цими захворюваннями.
2. Конкретні цілі:
1. Знати принципи та етапи проведення клініко-генеалогічного обстеження.
2. Знати критерії різних типів спадкування.
3. Запропонувати схеми родоводів аутосомно-домінантного, аутососмно-рецесивного, Х-зчепленого, мітохондріального типів успадкування.
4. Трактувати каріограми в нормі та при патології.
5. Знати методи пофарбування хромосом.
6. Знати типи порушень в хромосомному наборі: структурні, числові.
7. Визначати показання до проведення цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичних досліджень.
|
|
|
8. Трактувати поняття однобатьківська дисомія та хромосомний поліморфізм.
9. Засвоїти принципи організації скринуючих програм.
10. Засвоїти базові методи дослідження при підозрі на спадкові хвороби обміну речовин (СХО).
11. Проілюструвати прикладами значення біохімічних досліджень в уточненні діагнозу СХО.
12. Пояснювати показання для проведення тандемної мас-спектрометрії (МС).
13. Запропонувати схеми та алгоритм обстеження хворих з підозрою на СХО амінокислот, вуглеводів, сполучної тканини, органічні ацидурії.
14. Пояснювати метод ПЛР, як базовий метод молекулярної діагностики.
15. Знати базові молекулярні методи дослідження.
16.
Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція)
| Назви попередніх дисциплін | Отримані навики |
| 1. Анатомія 2. Фізіологія 3. Пропедевтика дитячих захворювань 4. Медична біологія 5. Біохімія | Вміти провести клінічне обстеження пробанда з підозрою на спадкову патологію, знати типи успадкування , розрахувати ризик народження в родині хворої дитини. |
Завдання для самостійної праці під час підготовки до заняття.
|
|
|
4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:
| Термін | Визначення |
| 1. Клініко-генеалогічний метод 2. Родовід 3. Пробанд 4. Сибси 5. Легенда родоводу 6. Типи спадкування 7.Ознаки мітохондріальної спадковості. 8. Ознаки при мультіфакторіальних захворюваннях. 9. Цитогенетика | 1. Це найбільш розроблений спосіб діагностики спадкових хвороб,який аналізує характер передачі різних ознак і хвороб в окремій сім’ї з вказанням родинних зв’язків між членами родоводу. 2. – це графічне зображення семейного древа. 3. – це людини, яка звернулась на консультацію до генетика. 4. – це діти однієї батьківської пари (брати, сестри). 5. – це короткий запис про кожного члена родоводу з точною характеристикою його споріднення з пробандом. 6. Аутосомно-домінантний, аутососмно-рецесивний, Х-зчеплений домінантний, Х-зчеплений рецесивний, Y- зчеплений,мітохондріальний,мультифакторіальний. 7. - хвороба передається тільки від матері; - хворі і хлопчики і дівчатка; - хворий батько не передає хворобу ні дочкам ні синами. 8. Ймовірність хвороби залежить від ступеню родства з хворим членом родини, тобто від числа сумісних генів; - число хворих родичів у сім’ї визначає прогноз для пробанда; - генетичний прогноз залежить від ступеню важкості хвороби враженого родича, т.я. ступінь важкості визначається сумарною дією декількох генів; - ймовірність виникнення захворювання збільшується в сім’ях, в яких хворий родич відноситься до рідко враженої статі. 9. – це галузь науки, яка вивчає структуру та функції хромосом |
4.2. Теоретичні питання до заняття:
|
|
|
1. Принципи та етапи проведення клініко-генеалогічного обстеження.
2. Назвіть критерії різних типів спадкування.
3. Ознаки родовода з аутосомно-домінантним типом успадкування.
4. Озн аки родовода з аутосомно-рецесивним типом успадкування.
5. Ознаки родовода з Х-зчепленим типом успадкування.
6. Ознаки родовода з мультифакторіальним типомс успадкування
7. Назвіть методи пофарбування хромосом.
8. Які є типи порушень в хромосомному наборі: структурні, числові.
9. Показання до проведення цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичних досліджень.
10. Що таке однобатьківська дисомія та хромосомний поліморфізм.
11. Принципи організації скринуючих програм.
12. Які методи дослідження використовують при підозрі на спадкові хвороби обміну речовин (СХО).
13. Обгрунтуйте значення біохімічних досліджень в уточненні діагнозу СХО.
14. Назвіть схеми та алгоритм обстеження хворих з підозрою на СХО амінокислот, вуглеводів, сполучної тканини, органічні ацидурії.
15. Поясніть метод ПЛР, як базовий метод молекулярної діагностики.
16. Назвіть базові молекулярні методи дослідження.
4.3.Практичні роботи (завдання), які виконуються на занятті:
1. Засвоїти етапи проведення клініко-генеалогічного обстеження.
2. Використовувати символи для складання родоводу.
3. Аналізувати по наданим родоводам різні типи успадкування:
- аутосомно-домінантного типа спадкування.
- аутосомно-рецесивного типа спадкування
- Х-зчепленого типа спадкування
- мультифакторіальних захворювань типа спадкування
4. Аналізувати і записувати каріограми.
5. Визначити принципи організації скринуючих програм.
6. Призначити біохімічні дослідження в уточненні діагнозу спадкових хвороб обміну речовин (СХО).
7. Застосовувати схеми та алгоритм обстеження хворих з підозрою на СХО амінокислот, вуглеводів, сполучної тканини, органічні ацидурії.
Зміст теми:
Цитогенетичний метод, його значення.
Цитогенетичний аналіз дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули.
Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) ґрунтується на мікроскопічному дослідженні структури і кількості хромосом. |Він набув широкого застосування в 20-х роках XX ст., коли було отримано перші відомості про кількість хромосом у людини. У 30-х роках ідентифіковано перших 10 пар хромосом.
У 1956 р. шведські вчені Дж.Тийо і А.Леван вперше довели, у людини 46, а не 48 хромосом.
Цитогенетичний метод використовують для:
• вивчення каріотипів організмів;
• уточнення числа хромосомних наборів, кількості і морфології хромосом для діагностики хромосомних хвороб;
• складання карт хромосом;
• для вивчення геномного і хромосомного мутаційного процес
• вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяція
Стандартні цитогенетичні методи:
1) ФТА - культивування лімфоцитів;
2) диференційне забарвлення хромосом - Y.О. R.С.
3) NOR - забарвлення ядерце-утворюючих ділянок акроцентричних хромосом.
Хромосомний набір людини містить велику кількість хромосом, основні відомості про які можна отримати при вивченні їх в метафазі мітозу і профазі - метафазі мейозу. Клітини людини для прямого хромосомного аналізу отримують шляхом біопсії кісткового мозку і гонад, або непрямим методом - шляхом культивування клітин периферичної крові (лімфоцити), коли отримують значну кількість метафаз. Непрямим методом досліджують також клітини амніотичної рідини або фібробласти, отримані при амніоцентезі або біопсії хоріона клітини абортусів, мертвонароджених та ін.
Частіше досліджують хромосоми в лімфоцитах периферичної крові із венозної, гепаринізованої крові (10 мл). Через 1 годину відстоювання в холодильнику, відсмоктують плазму, а лейкоцити розміщують у живильне середовище 199 або Ігла у співвідношенні 1:1,5. Для стимуляції мітозу додають фітогемаглютинін з розрахунку 0,1 мл на 10 см1 суміші, а також пеніцилін - 100 ОД на 1 см3 суміші. Культуру у флаконах поміщають у термостат при 37°С на 48 або 72 год. За 6 год до кінця інкубації додають колхіцин з розрахунку 0,5 мкг/ мл, який перериває поділ лімфоцитів на стадії метафази. Потім культуру знову поміщають у термостат на 2-4 год, після чого її зливають в центрифужні пробірки і центрифугують 5 хв при 800-1000 об/хв. Після центрифугування надосадову рідину зливають, а до осаду додають 5 мл гіпотонічного розчину. Використовують 0,95%-ий розчин цитрату натрію або 0,56%-ий розчин калій хлориду підігрітими до 37°С. У цьому розчині клітини витримують 7 хв, коли застосовують калій хлорид, або 15 хв якщо застосують цитрат натрію. Культуру знову центрифугують 5-7 хв за тої ж швидкості обертів. Перебування культури в гіпотонічному розчині і наступне центрифугування призводить до розриву ядерних оболонок і виходу хромосом у цитоплазму клітин.
Після центрифугування надосадову рідину зливають, а до осаду доливають 1-2 мл фіксатора, який складається із метилового (або етилового) спирту і льодяної оцтової кислоти у співвідношенні 3:1. Фіксацію проводять не менше 40 хвилин. За цей час фіксатор декілька разів зливають і додають свіжий (3-4 рази), поки клітинна суспензія не стане безбарвною. В останній порції фіксатора клітини суспензують і 3-4 краплі клітинної суспензії наносять на підготовлене предметне скельце. Висушують феном в струмені повітря і забарвлюють ядерними барвниками: 2% розчин ацеторсеїну, азуреозином, барвником Унна, розчином Гімза та ін. Накривають покривним скельцем, видаляють надлишок барвника фільтрувальним папером, розглядають під мікроскопом з масляної імерсією.
Останнім часом всі дослідження в цитогенетиці людини проводять із застосуванням методів диференційного забарвлення хромосом; розроблено нові методики забарвлення хромосом, які дозволяють відрізнити кожну хромосомну пару (диференціальне забарвлення хромосом). Існує декілька способів забарвлення: Q, G, С, К. У вирішенні питань діагностики хромосомних хвороб різні методи диференціального забарвлення застосовують у комбінації.
Завдяки диференціальному забарвленню хромосом можна виявити незначні хромосомні поломки: невеликі делеції, транслокації та ін. Хромосомні зміни виявляють, досліджуючи каріотип дорослого організму, в клітинах амніотичної рідини і в клітинах хоріону для діагностики хромосомних захворювань плода.
Одним із останніх сучасних методів уточнюючої цитогенетичної діагностики є високорозміщуючий молекулярно-цитогенетичний метод, який отримав назву гібридизація in sitn. Роздільна здатність методу складає 5х104п.о., тому він дозволяє досліджувати хромосомні сегменти довжиною від 5х10 (4) до 5х10 (6) n.о.
Для хромосоми або її ділянки, що вивчається, синтезують комплементарну послідовність ДНК і приєднують до неї мітку. "Міткою” можуть бути різні речовини, зокрема радіоактивні і флуоресцентні (флуорохроми). "Помічену" послідовність ДНК називають зондом. Зонд "знаходить" комплементарну послідовність в хромосомному наборі і приєднується до неї. Потім надлишок видаляють і проводять визначення сигналу гібридизації.
Відома модифікація цього метода, - флуорисцентна гібридизація.Для проведення Fish зонди різняться не тільки специфічністю по довжині, але і за способом мічення. Метод використовують не тільки для визначення розташування гена, але і для розшифрування складних хромосомних перебудов (уточнення хромосомних фрагментів, виявлення хромосомного мозаїцизму, розташування місць розривів при транслокації та ін.).
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 2485; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!