Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем
На основе исследований клеточных систем invitroбыл получен патент «Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест-систем» авторы Чеботарёв И.И., Никонов И.Н., Машенцева Н.Г., Чеботарёва С.Е., Фисинин В.И., Клабукова Д.Л.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области гигиенической безопасности объектов пищевого назначения. Предложен способ определения безопасности пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека. Способ включает три этапа: подготовку исследуемого объекта, подготовку тест-системы и определение безопасности объекта для тест-системы. Безопасность пищевых ингредиентов оценивают на основании определения жизнеспособности культуры клеток с использованием камеры Горяева и цитопатической активности изучаемых объектов. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности результатов определения безопасности пищевых ингредиентов для человека.
Рисунок 2 – Схема биотестирования безопасности пищевых ингредиентов на клеточных тест-системах.
Изобретение относится к области гигиенической безопасности объектов пищевого назначения и может быть использовано в биотехнологии для доклинической оценки токсичности биологически активных веществ и продуктов микробного синтеза, в пищевой промышленности для текущего контроля качества сырья, пищевых ингредиентов, добавок и получаемой продукции, а также в научно-исследовательских работах.
|
|
|
Обеспечение безопасности пищевых продуктов является важной частью санитарно-эпидемиологического благополучия населения, поскольку некачественные продукты питания могут приводить к заболеваниям различной этиологии. Для предотвращения этого необходимо тщательно проводить испытания токсичности объектов пищевого назначения, в том числе на этапе доклиники.
Биологическую оценку безопасности пищевых продуктов и ингредиентов проводят с использованием одноклеточных протистов, насекомых, мелких ракообразных, водорослей и семян высших растений.
Задачей изобретения является разработка эффективного способа определения безопасности пищевых ингредиентов для человека.
Техническим результатом заявляемого способа является расширение технологических возможностей способа, заключающихся в определении не только токсичности, но и в целом безопасности и функционального потенциала пищевых ингредиентов, а также повышение точности и достоверности результатов и их количественное определение.
Преимущества предлагаемого способа с применением культур клеток перед методами с использованием высших животных и простейших в следующем:
|
|
|
- возможна одновременная постановка большого количества опытов;
- возможность оценить динамику поведения клеточной системы в зависимости от времени, т.е. помимо острой токсичности объекта оценить хроническую токсичность;
- возможность в течение 24 ч сделать предварительное заключение о безвредности продукта;
- использование нескольких типов тканей и клеток человека дает основание для экстраполяции результатов на организм человека в целом;
- способ культивирования в монослое и прижизненное наблюдение клеток человека с помощью микроскопа позволяют определить их жизнеспособность и соответственно степень воздействия тестируемого объекта с большей точностью.
Предложенный способ определения безопасности пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека, включает три этапа:
1) подготовку исследуемого объекта: из исходной концентрации препарата готовят ряд двукратных серийных разведений убывающих концентраций; для приготовления разведений из каждой пробы ингредиента или продукта весовым или объемным методом отбирают навеску; масса (объем) навески индивидуальна для каждого конкретного ингредиента; для приготовления разведений водорастворимых объектов используют физраствор, для растворимых в органических растворителях - этиловый спирт, масла, при необходимости - растворители (ДМСО и др.), не обладающие цитотоксической активностью;
|
|
|
2) подготовку тест-системы: выращивают монослой клеток в культуральном флаконе площадью 25 см2 на соответствующей питательной среде ЕМЕМ, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС, 0,05% антибиотика гентамицина или пенициллина-стрептомицина; удаляют со сформировавшегося монослоя питательную среду; промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером, или раствором Версена, или физраствором;
3) определение безопасности объекта для тест-системы: во флакон со сформировавшимся монослоем клеток вносят 0,5 мл раствора тестируемого объекта и 10 мл питательной среды ЕМЕМ, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС; культивируют в течение 1 ч в CO2-инкубаторе при температуре 37°С и концентрации газа 5,0%; удаляют питательную среду и промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером, или раствором Версена, или физраствором; вносят 10 мл свежей питательной среды ЕМЕМ, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС; флакон помещают на 24 ч в СО2-инкубатор при температуре 37°С и концентрации газа 5,0%; удаляют питательную среду; снятие монослоя осуществляют 1 мл смеси растворов Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1; клетки окрашивают раствором красителя трипанового синего; производят подсчет живых и мертвых клеток с помощью камеры Горяева и определяют жизнеспособность и цитопатическую активность.
|
|
|
Заключение
Биотехнология животных организмов, клеток и тканей является интенсивно развивающимся направлением современной биотехнологии, успехи которой напрямую связаны с развитием генной инженерии и молекулярной биологии.
Разработаны методы экспериментальной биотехнологии воспроизводства лабораторных животных путем оплодотворения яйцеклеток invitro.
Параллельно с развитием биотехнологии воспроизводства животного организма усиленно разрабатываются технологии клеточной и генетической инженерии на основе животных клеток.
Не менее актуально для современной биотехнологии исследование стволовых клеток в качестве биологических объектов, используемых в медицине. Эти клетки способны самоподдерживаться в организме человека и животных длительное время. Они необходимы организму в любом месте, где возникает потребность в новых высокоспециализированных (дифференцированных) клетках, которые, как правило, утрачивают способность пролиферировать.
Таким образом, история традиционной биотехнологии, рассмотренная по каждому биологическому объекту отдельно - микробной, растительной и животной клетке смыкается на технологии рекомбинантной ДНК - нетрадиционной биотехнологии. Модифицированные микроорганизмы, трансгенные растения и животные - это дальнейшая история развития биологической науки, в том числе биотехнологии.
Список используемой литературы
1. Дмитруха Н.Н. Культура клеток как Invitro модель в токсикологических исследованиях.
2. КвеснтадзеГ.И. Введение в биотехнологию. /Г.И. Квеснтадзе.А.М. Безбородов // М.: Наука, 2002. 284 с.
3. Клабукова Д.Л. Разработка метода биотестирования безопасности пищевыхингредиентов с помощью клеточных тест-систем: дис. …канд. биол. наук: 03.01.06/ Клабукова Дарья Леонидовна. – Москва, 2017.
4. Король Е.В. Цитотоксическое действие Burkholderiacepacia на клетки Tetrahymenapyriformis при совместном культивировании / Е.В. Король, Л.К. Меринова, М.О. Нехезина // Вестник ВолгГМУ. – 2014. – № 1 (49). – С. 125 – 127.
5. Нетрусова А.И. Экология микроорганизмов: Учеб. //Под ред. А.И. Нетрусова. - М. 2004. 272 с.
6. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Второе изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 2005. — 832 с.
7. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток : практическое руководство / Р.Я. Фрешни; пер.5-го англ. изд. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2010. – 691 с.
8. Шевелухи В.С. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб.//Под ред. ВС. Шевелухи. - М., 2003.469 с.
9. ЩелкуновС.Н. Генетическая инженерия: Учебно-справ. пособие. 2-е изд., испр. и доп. - Новосибирск: Сиб.у нив. изд-во. 2004.496 с.
10. Патент № 2604802 РФ. МПК C12N 5/071, C12N 5/16, G01N 33/02, G01N 33/03. Клабукова Д.Л., Машенцева Н.Г., Никонов И.Н., Фисинин В.И., Чеботарева С.Е., Чеботарев И.Н. Способ определения безопасности пищевых ингредиентов с помощью клеточных тест- систем. Заявл. 25.12.2015. Опубл. 10.12.2016, Бюл. № 34.
11. Патент № 2604804 РФ. МПК C12N 5/071, C12N 5/16, G01N 33/569. Клабукова Д.Л., Машенцева Н.Г., Никонов И.Н., Фисинин В.И., Чеботарева С.Е., Чеботарев И.Н. Способ определения безопасности пробиотических микроорганизмов с помощью клеточных тест- систем. Заявл. 25.12.2015. Опубл. 10.12.2016, Бюл. № 34.
12. Hulst M. Oral administration of Lactobacillus plantarum 299v modulates gene expression in the ileum of pigs: prediction of crosstalk between intestinal immune cells and sub-mucosal adipocytes / Hulst M. [et al.] // Genes Nutr. – 2015. – V. 10, № 3. – P. 461.
13. Citar M. Human intestinal mucosa-associated Lactobacillus and Bifidobacterium strains with probiotic properties modulate IL-10, IL-6 and IL-12 gene expression in THP-1 cells / Citar M. [et al.] // Benef Microbes. – 2015. – V.6, № 3. – P. 325–336.
14. Freshney R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications // John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA, 6th edition. – 2010. – 796 p.
15. Guo X. Development of a real-time PCR method for Firmicutes and Bacteroidetes in faeces and its application to quantify intestinal population of obese and lean pigs / Guo X. [et al.] // Letters in Applied Microbiology. – 2008. – V.47. – P.367–373.
16. Kitts C.L. Terminal restriction fragment patterns: a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics // Current Issues in Intestinal Microbiology. – 2001. – № 2. – P. 17–25/
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 493; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!