Подбор клеточного материала. Культивирование
Практическое занятие №8.
№1. Хромосомы нормального кариотипа человека.
Кариотип - диплоидный набор хромосом данного вида организма, характеризующийся постоянным числом, величиной и формой хромосом. В кариотипе человека 46 хромосом или 23 пары. Парные хромосомы называют гомологичными, они имеют одинаковою длину и форму, содержат аллельные гены. В состав хромосом входит 40 % ДНК, 40 % гистоновых белков и 20 % негистоновых белков. Комплекс всех химических веществ, входящих в состав хромосом, называется хроматином. Хромосомы могут находиться в клетках в двух структурных и функциональных состояниях – спирализованном и деспирализованном. В период интерфазы они находятся в деспирализованном состоянии. В спирализованном состоянии они находятся в период митоза. Максимальной спирализации хромосомы достигают в метафазе митоза. Метафазная хромосома состоит из двух хроматид, соединенных в области первичной перетяжки (центромеры). Некоторые хромосомы имеют вторичные перетяжки и спутники. Центромера делит хроматиду на два плеча. Короткое плечо принято обозначать буквой p а длинное буквой q .
В 1960 г. английский генетик Патау предложил классифицировать хромосомы человека на основании относительной длины и положения центромеры (центромерного индекса). Центромерный индекс - отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы. В соответствии с центромерным индексом различают метацентрические (перетяжка посередине), субметацентрические (одно плечо длиннее второго), и акроцентрические хромосомы (с непропорционально очень коротким одним плечом).
|
|
|
№2. Международная классификация хромосом человека.
а) нумерация аутосом арабскими цифрами ;
В 1960 г на международном генетическом симпозиуме в Денвере (США) была принята Международная (Денверская) классификация хромосом человека. Основные принципы классификации разработал Патау. В классификации учтены длина и форма хромосом. Все пары аутосом нумеруют арабскими цифрами от 1 до 22 в порядке уменьшения их длины.
Б) группировка аутосом на семь групп А В С D Е F G
Все пары аутосом распределяются на 7 групп в соответствии с длиной и формой хромосом. Группы обозначают латинскими буквами от А до G. Группы четко отличаются друг от друга.
В) обозначение половых хромосом ( Х,Y)
Половые хромосомы обозначают латинскими буквами Х и У и располагают в конце раскладки. У женщин в норме половые хромосомы ХХ, а у мужчин ХУ.
Y-хромосома маленькая акроцентрическая хромосома длиной 2,8 мкм. Обычно (но не всегда) больше, чем хромосомы группы G, и хроматиды ее длинного плеча, как правило, лежат параллельно одна другой. Этим она отличается от хромосом группы G, у которых хроматиды длинных плеч образуют широкий угол.
|
|
|
Х хромосома сходна при рутинном окрашивании с хромосомами гриппы С, отличается при использовании дифференцированного окрашивания. Х - хромосома субметацентрическая, длиной 6,8 мкм.
№3. Характеристика А В С D Е F G
Группа А (1,2,3 пары) самые длинные метацентрические (1,3) и субметацентрическая (2) хромосомы. Хромосома 1 - самая большая метацентрическая хромосома, центромера расположена посередине. Самой большой субметацентрической хромосомой является хромосома 2. Хромосома 3 почти на 20% короче хромосомы 1 и, следовательно, легко идентифицируется. Абсолютная длина от 11 мкм (1 пара) до 8,3 мкм (2 пара).
Группа В (4 и 5 пары) длинные субметацентрические хромосомы. Они не различаются между собой без дифференцированного окрашивания. Абсолютная длина 7,7 мкм.
Группа С (6 – 12 пары). Хромосомы среднего размера, субметацентрические. При стандартном (рутинном) окрашивании Х-хромосому нельзя отличить от других хромосом этой группы. Она по размерам сходна с хромосомами 6 и 7 пары. Абсолютная длина от 7,7 мкм (6 пара) до 5,8 мкм.
Группа D (13 - 15 пары). Эти акроцентрические хромосомы по форме сильно отличаются от всех других хромосом человека. Все три пары на коротком плече содержат спутники. Длина проксимальных участков коротких плеч варьирует, спутники могут отсутствовать, а могут быть очень большими, могут ярко флуоресцировать, а могут и не давать флуоресценции. Абсолютная длина от 4,2 мкм.
|
|
|
Группа Е (16 - 18 пары). Относительно короткие субметацентрические хромосомы. Абсолютная длина 3,6-3,5 мкм.
Группа F - (19 – 20 пары) маленькие метацентрические хромосомы. В препаратах при рутинной окраске они выглядят одинаково, но при дифференциальном окрашивании резко различаются. Абсолютная длина 2,9 мкм.
Группа G (21 – 22 пары) – две пары самых маленьких акроцентрических хромосом. На коротком плече имеют спутник. Изменчивость их коротких плеч так же значительна, как и в хромосомах группы D. Абсолютная длина 2,9 мкм.
№4. Основные символы и сокращения для обозначения хромосомных аномалий: обозначения-плеч хромосом, аббераций хромосом , анеуплоидия.
• указывается общее число хромосом и набор половых хромосом, между ними ставится запятая (46, XX; 46, XY);
• отмечается какая хромосома лишняя или какой не хватает (это ука-зывается ее номером 5, 6 и др., или буквами данной группы А, В и др.); знаком «+» указывают на увеличение количества хромосом, знаком «-» указывают на отсутствие данной хромосомы 47, XY,+ 21;
|
|
|
• плечо хромосомы, в котором произошло изменение (удлинение короткого плеча указывается символом (р+); укорочение (р-); удлинение длинного плеча указывается символом (q+); укорочение (q-);
• символы перестроек (транслокация обозначается t, а делеция — del) помещают перед номерами вовлеченных хромосом, а перестроечные хромосомы заключают в скобки. Наличие двух структурно-аномальных хромосом обозначается точкой с запятой (;) или нормальной дробью (15/21).
№5. Цитогенетический метод и его возможности.
Цитогенетический метод основан на микроскопическом изучении хромосом в клетках человека
Современный этап в применении цитогенетического метода связан с разработанным в 1969 г. Т. Касперсоном методом дифференциального окрашивания хромосом, который расширил -возможности цитогенетического анализа, позволив точно идентифицировать хромосомы по характеру распределения в них окрашиваемых сегментов.
Применение: изучать нормальную морфологию хромосом и кариотипа в целом, определять генетический пол организма, диагностировать различные хромосомные болезни, связанные с изменением числа хромосом или с нарушением их структуры, позволяет изучать процессы мутагенеза на уровне хромосом и кариотипа, дает возможность путем своевременного прерывания беременности предупредить появление потомства с грубыми нарушениями развития.
Материаломдля цитогенетических исследований служат клетки человека, получаемые из разных тканей,—лимфоциты периферической крови, клетки костного мозга, фибробласты, клетки опухолей и эмбриональных тканей и др. Непременным требованием для изучения хромосом является наличие делящихся клеток (лимфоциты периферической крови - В норме эти клетки не делятся, однако специальная обработка их культуры фитогемагглютинином возвращает их в митотический цикл). Накопление делящихся клеток в стадии метафазы, когда хромосомы максимально спирализованы и хорошо видны в микроскоп, достигается обработкой культуры колхицином или колцемидом, разрушающим веретено деления и препятствующим расхождению хроматид.
Микроскопирование мазков позволяет визуально наблюдать хромосомы. Фотографирование метафазных пластинок и последующая обработка фотографий с составлением кариограмм позволяют установить общее число хромосом и обнаружить изменения их количества и структуры в отдельных парах.
В качестве экспресс-метода, выявляющего изменение числа половых хромосом, используют метод определения полового хроматина в неделящихся клетках слизистой оболочки щеки. Половой хроматин, или тельце Барра, образуется в клетках женского организма одной из двух Х-хромосом. Оно выглядит как интенсивно окрашенная глыбка, расположенная у ядерной оболочки. При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма в его клетках образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Х-хромосом. При уменьшении числа Х-хромосом (моносомия X) тельце Барра отсутствует.
В мужском кариотипе Y-хромосома может быть обнаружена по более интенсивной по сравнению с другими хромосомами люминесценции при обработке их акрихинипритом и изучении в ультрафиолетовом свете.
№6. Этапы цитогенетического метода.
этапы:
l подбор клеточного материала,
l культивирование соматических клеток на искусственных питательных средах (клетки человека быстро размножаются на питательных средах)
l добавление ФГА - фитогемагглютинина – стимулятора митоза,
l добавление колхицина – мутагена разрушающего веретено деления во время митоза, для остановки митоза на стадии метафазы
l обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие хромосомы набухают, рассыпаются и лежат свободно
l окрашивание хромосом
l изучение под микроскопом, фотографирование
l вырезание и построение идеограммы
Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазах митоза прометафазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно велико.
Подбор клеточного материала. Культивирование
Препараты хромосом можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки. У человека в большинстве случаев используют препараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластов кожи. Используют биоптаты семенников, слущенные эмбриональные клетки плода (аминиоцентез), плацетобиопсия (биопсия плода – хорионбиопсия и плаценты).
Наиболее простым и доступным методом является культивирование клеток крови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга – весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы invivo, вне культуры клеток, а сразу после взятия материала у пациента.
В крови здоровых людей нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, обработав их стимулятором митоза фитогемагглютинином ФГА. Берут один миллилитр периферической крови. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде invitro72 часа и затем готовят препараты хромосом. Чтобы остановить клетки в прометафазе, подавляют образование веретена деления веществами с колхицином. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клетки обрабатывают гипотоническим раствором. Затем каплю суспензии наносят на стекло и окрашивают.
Окрашивание.
Наиболее простой способ окрашивания – простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацетоорсеином или ацеткармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно.Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.
Для получения более детальной картины структуры хромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания. Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами протеазами. Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные - гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы. Дифференциальное окрашивание приводит к появлению линейного рисунка по длине хромосомы. Окрашивание может охватывать отдельные районы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментации зависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК – белок в разных участках по длине хромосом.
Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо.
Дата добавления: 2018-02-28; просмотров: 1791; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!