Трансгенный крупный рогатый скот

Лекция 15. Трансгенные растения и животные.

Трансгенные растения. Способность к вегетативному размножению отличает организм растений от организма высших животных, что заметно облегчает осуществление трансгеноза. Многие клетки растений, например, клетки зародыша на ранних стадиях его развития, покоящиеся клетки меристем кончиков побегов и корней, а также сосудистых тканей камбия, находятся в недетерминированном состоянии и, попадая под влияние внешних воздействий, могут дифференцироваться с образованием клеток любых типов, а также давать начало новым растениям.

Перенос в питательную среду таких недетерминированных клеток может приводить к их полной дедифференцировке и формированию в культуре недифференцированной ткани каллуса. Такие клетки могут стабилизироваться в жидких суспензионных культурах и расти неограниченно долго. Из недифференцированных тканей многих видов растений можно легко регенерировать целые растения.

Процесс получения трансгенных растений начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид , вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации , микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений.

Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам.

Метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов предложен В. Шибальским в 1988 г. Сущность метода заключается во введении в геном растений транс-действующих доминантных летальных генов или, по терминологии Шибальского, "анти-генов", которые кодируют измененные мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа прерывают его размножение. С использованием такого подхода удалось получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля (PVX) . В этом случае в ген репликазы PVX с помощьюнаправленного мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом PVX.

Еще один подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. С использованием такого метода создали эффективную систему защиты растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV) . Для этого сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с консервативными участками белка оболочки вируса. Клетки гибридомы использовали для конструирования библиотеки кДНК, из которой выделили последовательности нуклеотидов, кодирующие полноразмерные тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов G класса 2b. С помощью ПЦР и универсальных праймеров амплифицировали вариабельные участки этих последовательностей (VH и VL), которые далее клонировали в экспрессирующем векторе E. coli, что сопровождалось образованием полипептидов VH и VL, соединенных линкерным пептидом (антитела scFV). После отбора клонов, продуцирующих высокоаффинные антитела к вирусному антигену (scFV), объединенные таким образом гены VH-VL помещали в экспрессирующий вектор и использовали для получения трансгенных растений табака Nicotiana bentamiana. Трансгенные растения содержали в своих клетках до 0.1% антител от суммарного белка и оказались устойчивыми к AMCV-инфекции , но не к вирусу мозаики цветной капусты (CMV) , что указывало на специфический характер их резистентности.

Трансгенные растения сорго, устойчивые к гербицидам, получали бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами золота (диаметр частиц - 1,5-3,0 мкм). В таком случае микрочастицы погружали в раствор экспрессирующего вектора, высушивали и "выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов трансфекции.

Растения-биореакторы. Одним из перспективных направлений ДНК-технологий растений является создание растений-биореакторов, способных продуцировать белки, необходимые в медицине, фармакологии и др. К достоинствам растений-биореакторов относится отсутствие необходимости в кормлении и содержании, относительная простота создания и размножения, высокая продуктивность. Кроме того, чужеродные белки не вызывают иммунных реакций у растений, чего трудно добиться у животных.

Существует потребность в получении целого набора биологически активных белков, которые, из-за очень низкого уровня синтеза в специфических тканях или продуктах, недоступны для изучения по механизму действия, широкого использования или определения областей дополнительного применения. К таким белкам относится, например, лактоферрин, который находится в небольшом количестве в молоке млекопитающих, лейкоцитах крови.

Лактоферрин человека (hLF) перспективно использовать в качестве пищевой добавки и лечебного препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта детей раннего возраста, повышения иммунного ответа организма при злокачественных и ряде вирусных (СПИД) заболеваний. Получение лактоферрина из молока крупного рогатого скота, вследствие его низкого содержания, приводит к высокой стоимости препарата. При введении кДНК гена лактоферрина в клетки табака получен ряд каллусных тканей, синтезирующих укороченный лактоферрин, антибактериальные свойства которого были значительно сильнее антибактериальных свойств нативного лактоферрина. Концентрация этого укороченного лактоферрина в клетках табака составляла 0,6-2,5%.

В геном растений встраиваются гены, продукты которых индуцируют у человека и животных иммунный ответ, например, на оболочечные белки возбудителей различных заболеваний, в частности, холеры, гепатита, диареи, а также на антигены плазматических мембран некоторых опухолей.

Создаются трансгенные растения, несущие гены, продуцирующие некоторые гормоны, необходимые для гормонотерапии людей и так далее.

Примером использования растений для создания вакцин являются работы, выполненные в Стенфордском университете. В работе были получены антитела к одной из форм рака с помощью модернизированного вируса табачной мозаики, в который был встроен гипервариабельный участок иммуноглобулина лимфомы. Растения, зараженные модернизированным вирусом, продуцировали антитела правильной конформации в достаточном для клинического применения количестве. 80% мышей, получавших антитела, пережили лимфому, в то время как все мыши, не получавшие вакцины, погибли. Предложенный метод позволяет быстро получать специфичные для пациента антитела в достаточном для клинического применения количестве.

Велики перспективы использования растений для производства антител. Кевин Узил с сотрудниками показал, что антитела, продуцируемые соей, эффективно защищали мышей от инфекции вирусом герпеса. В сравнении с антителами, продуцируемыми в культурах клеток млекопитающих, антитела, продуцируемые растениями, имели сходные физические свойства, оставались стабильными в человеческих клетках и не имели отличий в способности связывать и нейтрализовать вирус. Клинические испытания показали, что использование антител, продуцируемых табаком, эффективно препятствовало размножению мутантных стрептококков, вызывающих кариес.

Было проведено создание вакцины, продуцируемой картофелем, против инсулинозависимого диабета. В клубнях картофеля накапливался химерный белок, состоящий из субъединицы В токсина холеры и проинсулина. Наличие субъединицы В облегчает потребление данного продукта клетками, что делает вакцину в 100 раз более эффективной. Скармливание клубней с микрограммовыми количествами инсулина мышам, больным диабетом, позволяло затормозить прогрессирование болезни.

Риск и возможная опасность ГМО и их научная проверка. В определенном смысле любой сорт выступает в качестве важнейшего для человечества рентообразующего фактора, как бы «озвучивающего» в цене величину и качество урожая благодаря лучшему использованию преимуществ местных почвенно-климатических и погодных условий, соответствию требованиям, а нередко и «прихотям» рынка, отзывчивости на применение техногенных факторов, применению новейших достижений науки и пр. В то же время при рыночной системе ценообразования и существующих методиках сортоиспытания далеко не всегда «улавливаются» преимущества нового сорта или гибрида, связанные с обеспечением экологической безопасности, т.е. их пригодностью к природоохранным, в том числе беспестицидным, технологиям возделывания, способностью усваивать труднодоступные элементы питания, противостоять кислотности и засолению почвы, обогащать ее биологическим азотом, улучшать физико-химическое и фитосанитарное состояние и тд. То обстоятельство, что в условиях рыночной экономики цены на сельскохозяйственную продукцию практически не учитывают средоохранные, ресурсосберегающие, почвоулучшающие и многие другие важные в экологическом плане признаки и свойства новых сортов, следует рассматривать в качестве хотя и временного, но весьма негативного явления.

Далеко не всегда в цене «озвучивается» и содержание в урожае биологически ценных, в том числе незаменимых, веществ. Между тем проблемы здоровья, питания и ресурсов всегда взаимосвязаны, а качество пищи и лекарства справедливо считаются двумя сторонами одной и той же медали под названием здоровье. С учетом решающего значения сорта в определении показателей «качества пищи», а следовательно, и «качества жизни» людей рентообразующим свойствам сорта, связанным с содержанием биологически и технологически ценных веществ (углеводов, аминокислот, жиров, витаминов, минеральных солей и др.), вкусом, эстетичностью, безопасностью для здоровья (отсутствие нитритов и нитрозаминов, тяжелых металлов, радионуклидов, микотоксинов и пр.), в процессе селекции и возделывания растений необходимо уделять особое внимание. Так, энергетическая и протеиновая ценность кормовых культур и соответствующих сортов должна формироваться в строгом соответствии с технологиями их возделывания, транспортировки, хранения и переработки, а также условиями содержания животных, более того, даже с учетом особенностей производства той или иной животноводческой продукции.

Например, важную роль приобретает создание сортов клевера с высокой растворимостью протеина (разброс данного показателя по сортам — от 20 до 70%), что позволило бы приблизить эту культуру по питательной ценности к люцерне. Поэтому в селекционном процессе, так же как и при нормировании кормов, важно учитывать не только валовое содержание, но и все большее число составляющих их биологически ценных веществ, определяющих в конечном счете питательную ценность кормов по обменной энергии и перевариваемому протеину. В этой связи должны быть разработаны соответствующие коэффициенты биоконверсии не только для каждой кормовой культуры и сорта, вида животного и технологии его содержания, но и для определенного типа фитоценоза (лугового или полевого) и т.д.

Как уже отмечалось выше, одной из возможностей уменьшения загрязнения генотоксическими агентами окружающей среды в связи с химизацией сельского хозяйства является широкое использование ГМ растений. Но оно требует объективного анализа рисков распространения ГМО. При рассмотрении проблемы возможного влияния трансгенных растений на окружающую среду в основном обсуждаются 3 аспекта:

1. Сконструированные гены могут быть переданы с пыльцой близкородственным диким видам, и их гибридное потомство приобретет новые привнесенные свойства или способность конкурировать с другими растениями.

2. Трансгенные сельскохозяйственные растения могут стать сорняками для сельского хозяйства и вытеснить произрастающие рядом другие растения.

3. Трансгенные растения могут стать прямой угрозой для человека, домашних и диких животных (например, из-за их токсичности или аллергенноcти).

К настоящему времени выполнены экспериментальные исследования этих возможностей и получены следующие данные.

Проведена оценка трансгенного рапса по способности к инвазии с целью определения: станут ли гербицидустойчивые растения более склонными к распространению в естественных условиях. При изучении демографических параметров трансгенного и обычного рапса, выращивавшихся в различных местах и различных климатических условиях, получены данные прямого сравнения 3 различных генетических линий — контроль, канамицинустойчивая линия и гербицидустойчивая линия — Баста.

Несмотря на значительные колебания по выживанию семян (при их хранении в земле), росту растений и семенной продуктивности, не обнаружены данные, указывающие, что генетическая инженерия по канамицин- и гербицидустойчивости усилила инвазивные свойства рапса. В случаях, когда наблюдали значительные различия, например, по выживанию семян, трансгенные растения оказались менее стойкими по сравнению с обычными.

При изучении частоты переноса гена bar (устойчивости к гербициду Баста) трансгенным рапсом были засеяны окружности диаметром 9 м среди гектара обычных растений. Для улучшения перекрестного опыления в поле стояли ульи с пчелами. Семена собирали на расстоянии 1,3, 12 и 47 м от этих окружностей и в потомстве определяли наличие гибридных растений.

Частота перекрестного опыления составила на расстоянии 1м — 1,4%, 3 м — 0,4%, 12 м — 0,02% и 47 м — 0,00034% (3 гибрида на миллион растений).

Определение частоты перекрестного опыления между трансгенным картофелем S.nigrum и S.dulcamara показало, что когда трансгенные и контрольные растения выращивали в соседних рядах, то частота скрещивания между ними составляла 24%. При увеличении расстояния до 10 м она составляла 0,017%, а при 20 м гибридных растений не обнаружено.

Еще одним аспектом влияния трансгенных растений на окружающую среду является получение трансгенных растений с лучшей способностью использовать минеральные соединения, что, кроме усиления роста, будет также препятствовать смыву химикатов в фунтовые воды и попаданию в источники водопотребления.

Ген CHL1 арабидопсиса контролирует транспорт нитратов и влияет на их поглощение из почвы. Изолирован гомологичный ему ген OsNTI. У трансгенных растений арабидопсиса с геном CHL1 поглощение азота усиливалось. ДНК CHL1 и OsNTI была слита с промоторами Act1 и Ubi1, и эти конструкции были интродуцированы в растения риса. Среди трансгенных растений, подвергнутых анализу, растение со множественными инсерциями Ubi1-CHL1 характеризовалось типичным для растений с повышенным поглощением нитратов соотношением корневой массы к надземной.

Ген глюкуронидазы (GUS), изолированный из Escherichia coli, — один из наиболее широко используемых репортерных генов у трансгенных растений. Этот ген чаще всего используется для изучения экспрессии генов при его подстановке под промоторы соответствующих генов. Выпуск на рынок трансгенных сортов сельскохозяйственных растений, имеющих GUS ген в качестве репортерного, требует оценки биобезопасности этого гена.

GUS-активность обнаружена у многих видов бактерий и поэтому представлена в организмах беспозвоночных и позвоночных. В организмах позвоночных GUS-активность обязана попаданию энтеробактерии Escherichia coli, обитающей в кишечном тракте, в почве и фунтовых водах, поэтому дополнительная активность GUS, добавленная в экосистему за счет трансгенных растений, не изменит существующую ситуацию вовсе или изменит незначительно.

Нет оснований полагать, что трансгенные культуры, экспрессирующие GUS ген, будут иметь какие-либо преимущества перед другими культурами и будут сорняками или такими преимуществами станут обладать сорняки, получившие этот ген за счет скрещивания с родственными видами сельскохозяйственных растений.

Так как глюкуронидаза встречается естественно в кишечном тракте человека и других позвоночных, ее наличие в пище или в кормах, полученных из трансгенных растений, не причинит им вреда. Поэтому наличие GUS гена в трансгенных растениях считается безопасным для человека, животных и окружающей среды.

Среди естественных компонентов биосферы значительное место занимают микроорганизмы. В силу высокой скорости эволюции микроорганизмы наиболее эффективно реагируют на изменение окружающей среды, так что исследование природных микробных сообществ позволяет наиболее оперативно оценить влияние изменений окружающей среды на биоразнообразие. Такие исследования приобретают в последние годы большое значение в связи с широким распространением генетически модифицированных микроорганизмов и возможным попаданием их в естественные микробные сообщества. Все эти воздействия могут создать проблемы, связанные с распространением чужеродных генетических конструкций в природных сообществах — так называемым горизонтальным переносом генов, что неминуемо приведет к существенному ускорению эволюции микробных сообществ, появлению новых форм с новыми генетическими признаками. Оценка устойчивости таких форм и содержащихся в них конструкций, а также последствий их появления в природе чрезвычайно важна для разработки стратегий последующего развития общества.

Для оценки возможного влияния генетически модифицированных растений на экосистемы почвы листья контрольных и трансгенных растений табака с геном ингибитора протеазы 1,7, обладающих инсектицидной активностью, помещали в почву. Содержание ингибитора протеазы через 5-7 дней составляло 0,05% от исходного количества и через 2 недели уже не детектировалось. Количество нематод в почве около остатков трансгенных растений было выше, чем около контрольных растений. Популяция Collembola, наоборот, была менее плотной возле остатков трансгенных растений, что указывает на наличие влияния остатков трансгенных растений на популяции нематод и Collembola.

Иногда высказываются опасения о возможном горизонтальном переносе генов от трансгенных растений в почвенные микроорганизмы. Определена частота возможной трансформации почвенной бактерии Acinetobacter calcoaceticus BD413 ДНК трансгенных растений при двух источниках ДНК растений, различных форм плазмидной ДНК с геном nptll. Трансформанты при использовании ДНК трансгенных растений не обнаружены, что предполагает частоту трансформации ниже 10^-13 транс формантов на реципиент в оптимальных условиях. Однако в условиях почвы, при снижении концентрации ДНК, доступной бактериям, эта частота должна снизиться до 10^-16. Учитывая ранее полученные данные об ограниченном времени сохранения хромосомной ДНК и невозможности определения детектируемой компетентности клеток A.calcoaceticus в почвенных условиях, полученные результаты приводят к выводу о неопределяемой частоте возможного поглощения растительной ДНК этим почвенным микроорганизмом в естественных условиях.

Изучена стабильность ДНК в листовом опаде трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к ризомании, и возможность горизонтального переноса ДНК от растений к бактериям. Трансгенные растения несли NPTII и bar гены. Показана длительная сохранность растительной ДНК в почве.

Не обнаружен перенос специфичных конструкций трансгенной ДНК к микроорганизмам, изолированным из почвы.

Исследования показывают, что экологический риск при выращивании трансгенных растений можно сравнить с риском испытания новых селекционных сортов, полученных без применения биотехнологических методов. Все соединения, которые появляются в трансгенных растениях, уже существуют в природе. Все дело в скорости появления этих признаков у растений. То, что в природе произошло бы за тысячелетия, в экспериментах ученых происходит за годы.

Следует ли опасаться появления трансгенных растений, скажем, того же масличного рапса, устойчивого к гербицидам, потому, что он может скреститься с сурепкой и та станет устойчивой к этому гербициду? Определенный риск, конечно, существует, однако о появлении сорняков, устойчивых к гербицидам, известно уже давно и это не вызывало ранее никаких опасений. Просто подбирали другой гербицид, к которому данный сорняк был нестойким. Так же и в случае появления сорняков, устойчивых к какому-либо гербициду за счет скрещивания с трансгенными гербицидустойчивыми растениями, будут применены другие гербициды, которые и уничтожат эти сорняки, но оставят трансгенные растения, устойчивые к этому гербициду.

Одной из заманчивых возможностей ДНК-технологии является создание генетически модифицированных культурных растений, устойчивых к классу гербицидов сплошного действия. В таком случае, при применении гербицидов сплошного действия, на площади будут уничтожены все растения за исключением культуры, которая обладает генетически обусловленной устойчивостью к данному гербициду. Это было бы идеальным вариантом контроля вредоносности сорняков.

Существует ли опасность изменения трансгенных растений таким образом, что они станут токсичными для человека и животных? Даже теоретически трудно себе представить, что введение одного или несколько генов в высший эукариотический организм, геном которого состоит из десятков тысяч генов, так изменит его метаболизм, что это растение станет синтезировать какие-либо токсические соединения, не связанные с экспрессией введенного гена. Конечно, в каждом случае внесения нового гена получаемые трансгенные растения должны проходить тщательные испытания. При этом исследуют продукты метаболизма, кодируемые вносимым геном, и только после этого такие трансгенные растения изучают в полевых условиях.

И хотя обмен генов между сконструированными трансгенными растениями и родственными им культурными и дикими видами, по мнению большинства биотехнологов, не представляет угрозы для окружающей среды, предпринимаются попытки разработки системы, полностью препятствующей такому переносу генов. Одним из подходов к решению этой проблемы является создание стерильных мужских растений. Однако, несмотря на свою эффективность, в настоящее время он ограничен небольшим количеством видов сельскохозяйственных растений.

Другим подходом является внесение желаемых генов в хлоропластный геном. Для подавляющего большинства видов культурных растений хлоропласты наследуются строго по материнскому типу и, таким образом, трансгены не будут передаваться с пыльцой. Первые исследования в этом направлении были по материнской линии проведены в лаборатории П. Малиги и показали возможность внесения в хлоропластный геном маркерных генов.

Таким образом, можно суммировать имеющуюся информацию об опасностях, которые надо учитывать, в следующих пунктах.

1. Принцип создания векторов — имитация естественного процесса горизонтальной передачи наследственной информации, при которой вовлекаются эволюционно естественные пути обмена генетического материала; не исключен запуск событий, которые могут привести к изменениям межвидовых барьеров переноса генетического материала патогенов.

2. Интеграция нового материала в геном не может к настоящему времени рассматриваться как полностью прогнозируемый процесс — возможен запуск событий «инсерционного» мутагенеза.

3. У генетически модифицированных растений: а) модификации, связанные с увеличением устойчивости к гербицидам и паразитам, не учитывают традиционные проблемы коэволюции хозяина и паразита, возможность передачи генетического материала устойчивости сорнякам; б) модификации с целью получения фармакологических препаратов не учитывают неисследованные последствия для иммунной системы человека и животных изменений антигенного состава пищевых продуктов; в) не учитывается тот факт, что широкое использование генетически модифицированных растений неизбежно приводит к изменениям биоразнообразия в глобальном масштабе.

4. У генетически модифицированных животных: а) при их получении в целях увеличения продуктивности недостаточно исследованы последствия использования человеком продукции генетически модифицированных животных для эндокринной и иммунной систем человека, а также потенциальных источников распространения дестабилизирующих генетических элементов; б) при использовании ГМ животных для тиражирования геномов высокопродуктивных особей не исключено распространение скрытых генетических дефектов, а также изменение биоразнообразия внутри сельскохозяйственных пород; в) в терапевтических целях — недостаточно изучены последствия преодоления трансплантационного межвидового барьера, не исключены влияния на иммунную систему хозяина, а также возможно облегчение преодоления межвидового барьера патогенами.

В проблеме трансгеноза есть ряд нерешенных и теоретических проблем, например, одна из них — сайленсинг, «замолкание» встроенных генов. Это явление известно довольно давно, но конкретные механизмы, приводящие к выключению встроенных генов, пока не вполне ясны. Созданы специальные модели для изучения влияния числа копий генов. За контроль взята встройка одной копии гена глюкуронидазы в связке с геном-репортером по канамицинустойчивости, двух копий генов в прямой последовательности и тех же двух копий, но уже инвертированных друг к другу. Введение повторенных нуклеотидных последовательностей в виде прямых и особенно инвертированных повторов резко снижает уровень экспрессии гена канамицинустойчивости. Влияние числа копий или места встройки переносимых генов на их экспрессию, уровень активности или полное выключение — лишь один из механизмов явления сайленсинга, активно изучаемого в ряде лабораторий.

Другая важная проблема в процессе трансгеноза — возникновение мутаций как следствие встройки чужеродной ДНК (Т-ДНК инсерций). Собрана целая коллекция Т-ДНК индуцированных мутаций, характеризующихся, например, измененным строением цветка и мужской стерильностью. Мутантные фенотипы появляются с частотой до 5%. Установлено, что у большей части проанализированных растений мутантный фенотип наследуется сцепленно с признаком устойчивости к антибиотику канамицину, что свидетельствует об инсерционной природе мутационных событий в результате интеграции чужеродной ДНК в геном растений.

Очевидно, что для предупреждения вышеперечисленных событий, прежде всего, необходимо:

1. Наличие в генных конструкциях специальных последовательностей, позволяющих легко уничтожать клетки — их носители.

2. Использование традиционных приемов проверки на мутагенную активность всей продукции, связанной с ДНК-технологиями, с обязательным использованием тестов in vivo — лабораторных линий мышей и клеточных культур человека с учетом возможных кумулятивных эффектов со стрессирующими агентами.

3. Контроль изменения генофондов популяций трансгенных растений и животных, их репродуктивной изоляции от полученных традиционным путем.

4. Контроль изменения биотической компоненты агросистем, в которых разводятся трансгенные растения (микрофлора почвы, сорняки, насекомые и т.д.).

К сложностям использования генетически модифицированных растений, устойчивых к насекомым, относят следующие:

1. Возможность приобретения насекомыми толерантности к токсинам. Так, обнаружено, что у сельскохозяйственного вредителя — кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis) есть формы, устойчивые к Bt-токсину. Устойчивость контролируется аутосомным геном с неполным доминированием. Это может в скором будущем сделать использование Bt-модифицированных растений бессмысленным.

2. Противоречивость данных о токсичности для теплокровных животных и людей.

Исходя из этого, дальнейшее развитие использования ДНК-технологий в защите растений от насекомых будет осуществляться в направлении создания генетически модифицированных растений, несущих гены более эффективных и безопасных инсектицидов. Так, например, в последнее время развернуты работы по замене в генных конструкциях при получении трансгенных растений, устойчивых к насекомым, бактериального гена Bt-токсина на ген яичного белка авидина курицы. Принцип его действия основан на том, что авидин, накапливающийся в растениях, приводит к дефициту витамина биотина в тканях насекомых, что блокирует их онтогенез и приводит к их гибели. В то же время продукт гена авидина входит в пищу человека; его концентрации в трансгенных растениях, токсичные для насекомых, нетоксичны для человека, и даже при избыточном потреблении таких растений человеком возможные негативные эффекты могут быть скомпенсированы введением в пищу биотина.

В настоящее время в дискуссиях по проблемам генетической инженерии основной упор делается на критериях, показателях и методах оценки пищевой безопасности генетически модифицированных организмов и получаемых из них продуктов. Между тем главное внимание, на наш взгляд. должно быть уделено эволюционной, биологической и экологической безопасности ГМО. Вся история развития сельского хозяйства (да и цивилизации в целом) многократно доказывала пагубность подмены широкого научного базиса узким сиюминутным прагматизмом и всякого рода целесообразностью (экономической, политической, конъюнктурной и пр.). Санитарно-гигиеническая и медико-биологическая экспертизы играют хотя и важную, но только вспомогательную роль, когда речь идет об эволюции организмов, действительно управляемой волей человека. Кроме того, следует соотносить угрозу голода (которая вполне реальна) с действительными возможностями биоинженерии вообще и генетической инженерии в частности в обеспечении продовольственной безопасности населения в предстоящий период.

Трансгенные животные. Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных

стволовых клеток и трансфекции их клонированным геном. При этом вводимая конструкция должна интегрироваться в геном стволовых клеток. Клетки, несущие ген-мишень в определенном хромосомном сайте, отбирают и культивируют, а затем вводят их в мышиные эмбрионы на ранних стадиях развития. Мышиные эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны (тотипотентны), т. е. могут дать начало клеткам любого типа, в том числе и клеткам зародышевой линии. Для трансгеноза используют также искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), несущие множество генов. Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения генетических болезней человека (например, болезни Альцгеймера).

С помощью аналогичных экспериментальных подходов были получены трансгенные коровы, овцы, свиньи, птицы и рыбы. Есть надежда, что трансгеноз позволит улучшать генотип существующих пород домашнего скота и выводить породы животных с новыми признаками. Кроме того, возможно, таких домашних животных, как коровы, овцы и козы, удастся использовать в качестве своеобразных «биологических фабрик» для получения продуктов клонированных генов, секретируемых в молоко.

Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным" геном может нести также и «вредные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно новую стратегию.

Получение трансгенных животных. Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген или гены. Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые перенесут новые свойства потомкам. У растений и животных целесообразно изменять такие свойства, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям, способность адаптироваться к новым внешним условиям. В качестве маркеров в этом случае можно использовать полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (AFLP), анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной ДНК (SSR), гибридизацию и т.д.

Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. От работы с довольно крупными яйцами амфибий перешли к изучению яйцеклеток и эмбрионов мыши, которая представляет наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее.

Микроинъекцию клонированных генов производят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер - от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 - 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Интеграция чужеродных генов неспецифична по отношению к хромосомам, а число копий чужеродного гена может различаться от нескольких штук до 100 и более. Эти гены образуют группу тандемных повторов, объединенных по типу "голова к хвосту". Чужеродная ДНК после инъекции была обнаружена как в соматических, так и в половых клетках. Это означает, что интеграция проходит на самых ранних стадиях развития зиготы.

В нескольких случаях гетерологичная ДНК наследовалась в трех поколениях мышей, что свидетельствует о стабильной интеграции. Интегрировавшая в половые клетки ДНК передается как менделевский ген. Установлено, что уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с хромосомами и от степени ее метилирования, а также от дифференцировки тканей. В некоторых случаях удалось получить тканеспецифическую экспрессию. Важно отметить что специфические чужеродные гены можно встраивать в геном клетки таким образом, что они подчиняются нормальным регуляторным сигналам.

В 1981 году Константини и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию в яйцеклетки мыши фрагменты хромосомной ДНК кролика длиной 19 килобаз. Эти фрагменты содержали ген β-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали до стадии бластоцисты и имплантировали в матку. У 24 мышей, родившихся в результате развития имплантированных яйцеклеток, проведены частичная гепатоэктомия. Анализ ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей встречается от 1 до 20 копий на клетку гена β-глобина. После спаривания 4 трансформированных самцов с нормальными самками получили потомство из 18 животных. 6 из них также имели ген β-глобина. Установлено, что интеграция гена в клетки млекопитающих происходит случайным образом и не связана с конкретными областями хромосомы. Ген нестабилен, может быть утрачен или стать неактивным. Вместе с геном необходимо вводить регуляторные последовательности.

Метод введения генов в эмбриональные клетки имеет ограничения. Не всегда удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы. Разработанные методические примы пока не позволяют заменить имеющийся в геноме ген, вытесняя его, не всегда удается подчинить новый ген системе регуляции организма.

При трансгенозе могут возникать неожиданные проблемы. Например, одни из первых работ по генетической транформации животных проводились путем встраивания генов гормона роста. Перенос гена гормона роста крысы мышам увеличивал рост мышей в 2 раза. Эксперименты по трансгенозу генов гормона роста быка кроликам также увенчались успехом. А вот аналогичные эксперименты по модификации крупного рогатого скота привели к увеличению прироста всего на 10-20%. Очевидно, это связанно с тем, что у мышей сохраняется широкая норма реакции, и встраивание генов, увеличивающих количество гормона, заставляет генотип реализоваться максимально полно. У домашнего скота в результате направленной селекции организмы работают на верхнем пределе нормы реакции, отсюда ожидаемый эффект не проявился.

В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. Такие трансгенные свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке (животное-ферментер). Уже получены трансгенные коровы, в молоке которых содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируют применять для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью. Это больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию. Ведутся клинические испытания такого молока. Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота, содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани (фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого белка. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную яйцеклетку рождается от только 5 - 10% трансформированных животных, из них - несколько самцов, не дающих молока.

Использование новой технологии клонирования позволяет получать животных только женского пола, дающих трансгенный протеин. Альбумин используется в терапии для поддержания осмотического давления в крови. Ежегодно в мире требуется около 440 тысяч литров плазмы крови для выделения этого белка (стоимость около 1,5 млрд. $). Каждая молочная корова может произвести 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина ежегодно. Genzyme Transgenics занимается разработкой аналогичных методов получения человеческого гормона роста и β-интерферона.

В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови.

В нашей стране были попытки создать овец, продуцирующих химозин (фермент для сыроварения). Было получено 2 овцы, у одной – ген не экспрессировался, у второй содержание химозина достигало 300 мг/л. Однако потомство этой овцы давало низкие удои – порядка 50 кг за период лактации. Причина заключалась в том, что химозин вырабатывается в виде предшественника – прохимозина, который превращается в активный фермент при рН=5. Было запланировано получать именно прохимозин, но в каких-то участках вымени происходило снижение рН, что приводило к активации химозина непосредственно в организме. Активный химозин свертывал молоко, а оно закупоривало протоки вымени. Сейчас пытаются решить эту проблему.

В Подмосковье получены кролики, выделяющие γ-интерферон, эритропоэтин, но кролики не являются традиционными продуцентами молока. Эксперименты же по трансформации сельскохозяйственных животных очень дорогостоящи – одно трансгенное животное стоит десятки и сотни тысяч долларов.

Трансгенных животных получают и для целей ксенотрансплантации. Одним из излюбленных доноров органов являются свиньи, так как имеется анатомическое сходство органов и сходство иммунологических свойств. Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.

Еще одно направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Животноводство держится на вакцинах, так как селекция ведется преимущественно на хозяйственно ценные признаки – шерстистость, молочность и т. д. Повышение устойчивости – дело генных инженеров. К защитным белкам относятся интерфероны, поэтому ген интерферона встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость, они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Другое направление – введение генов, кодирующих антисмысловую РНК. Для животноводства острой проблемой являются лейкозы, вызываемые РНК-вирусами. Трансгенные кролики, несущие гены, отвечающие за присутствие в клетке антисмысловой РНК, были устойчивы к лейкозам.

Трансгенных животных можно использовать для изучения наследственных заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка β-амилоида приводит к образованию характерных бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические приемы.

Трансгенных животных стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например, ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом.

Трансгенный крупный рогатый скот

Если предполагается использовать молочную железу в качестве «биореактора», то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза является крупный рогатый скот, который ежегодно дает до 10 000 л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантно-го белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько белка С, использующегося для предотвращения тромбообразования, требуется ежегодно. С другой стороны, одной трансгенной коровы будет более чем достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови. Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение количества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрессии трансгена этого белка. Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно будет получать молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для многих людей, не переносящих лактозу; после приема молока или молочных продуктов у них возникает серьезное желудочное расстройство. Трансгеноз крупного рогатого скота — это весьма перспективный подход, но создание большого числа трансгенных животных потребует времени, ведь для того чтобы вырастить половозрелое животное из оплодотворенной яйцеклетки, нужно примерно 2 года.

Весьма актуально создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям. Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бактериальным инфекционным заболеваниям — маститу (коровы), дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать несущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболеваниями домашних животных используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тщательное наблюдение. Стоимость всех этих мероприятий может достигать 20% обшей стоимости конечной продукции.

Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моно-клонального антитела. Идея этого подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок.

Трансгенные овцы, козы и свиньи . Опыты по трансгенозу в случае овец и коз в основном были направлены на превращение молочных желез этих животных в своеобразные биореакторы для получения белковых продуктов, использующихся в медицине. Несмотря на то что надои у овец и коз меньше, чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода, аналогичного используемому для создания трансгенных мышеи и трансгенных конструкций, содержащих гены человека под контролем промоторов, специфичных для молочных желез (табл. 19.2), были созданы трансгенные овца и коза, в молоко которых секретировались белки человека. Они были гликозилированы и обладали активностью, близкой к таковой соответствующих белков, получаемых от человека. Однако, для того чтобы убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны дополнительные исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потомство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычьего гормона роста под контролем промотора металлотионеина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны. Возможно, они связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтезировался более или менее непрерывно. Были созданы также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста 1 была помещена под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, что обеспечивало гиперэкспрессию кДНК, При этом у трансгенных овец в отличие от свиней никаких нежелательных побочных эффектов не наблюдалось.

В последнее время большое внимание уделяется вопросу об использовании органов животных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря пересаженного органа.

В естественных условиях воспалительная реакция блокируется особыми белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов. Эти белки ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказано предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то пересаженный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различные человеческие гены ингибитора комплемента. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше. Возможно, трансгенные свиньи, несущие человеческий ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для трансплантации человеку.

Трансгенные птицы . Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микроинъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками.

Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих пород — для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызываемым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холе-стерола в яйцах, повышения качества мяса. Было предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрессия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое количество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового продукта в яйце, откуда его можно затем выделить.

Дата добавления: 2022-06-11; просмотров: 26; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

Мы поможем в написании ваших работ!