СТРУКТУРЫ, СВЯЗАННЫЕ С ПЛАЗМАЛЕММОЙ
Лекция 5.
Система эндосом
Термин «эндоцитоз» обобщает процессы интернализации растворенных веществ и жидкости, макромолекул, компонентов плазмалеммы и всевозможных частиц путем формирования углубления плазмалеммы и отшнуровки мембранного пузырька. В клетках многоклеточных организмов эндоцитированный материал включает широкий спектр лиганд-рецепторных комплексов, жидкостей, липидов, мембранных белков, компонентов внеклеточного матрикса, «обломки» разрушенных клеток, бактерии, вирусы и многое другое. Посредством «обработки», сортировки, рециркуляции, активации, блокирования и деструкции захваченных веществ и рецепторов ЭНДОСОМЫ «отвечают» за регуляцию различных процессов в клетке.
Эндоцтоз вовлечен в передачу сигналов, рост клетки, регуляцию клеточного метаболизма, защитные реакции. Процессы эндоцитоза присутствуют практически во всех аспектах жизнедеятельности клеток. Эндоцитоз – интернализация различных лигандов, внеклеточной жидкости и фрагментов мембран посредством мембранных пузырьков. В «типичной» клетке млекопитающих 50-180% площади плазматической мембраны обновляется за час путем эндоцитоза. Макрофаг интернализует около 30% своего объема за час, при этом около 2/3 объема возвращается во внеклеточное пространство в течение 15-20 минут.
Первой «станцией» этого транспортного потока при эндоцитозе является ранняя эндосома, где происходит сортировка интернализованных лигандов, - на деградацию и рециркуляцию. Ранние эндосомы входят в систему эндосом, включающую также поздние и рециркулирующие ( recycling ) эндосомы. Разные эндосомы отличаются маркерами и морфологией и, конечно, имеют разные функции.
|
|
|
Ранние эндосомы – мембранные структуры округлой формы (до 1 мкм в диаметре) с трубчатыми выростами (около 50 нм в диаметре). Имеют очень изменчивую форму. Маркеры - белки RAB5 и RAB4. Выявляют ранние эндосомы с помощью трансферина и его рецептора, а также антител к белку ранних эндосом (ЕЕА1). рН в просвете ранних эндосом около 6.
Главная функция ранних эндосом – сортировка интернализованных молекул. Процесс сортировки происходит в течение 3 – 5 минут после интернализации. Многие интернализованные лиганды направляются на деградацию, тогда как их рецепторы возвращаются в плазмалемму для дальнейшего использования. Эндосомы занимают важное место в реализации полученных клеткой молекулярных сигналов, от точности их работы зависит развитие правильного эффекта.
Морфологические различия разных частей эндосомы имеют важное функциональное значение. Так, белки, предназначенные для рециркуляции, обычно накапливаются в тубулярных элементах эндосом, тогда как мультивезикулярная часть («тело» эндосомы) обычно вовлечена в сортировку молекул для деградации. Пузырьки, формирующиеся на мембранах разных компартментов ранней эндосомы по-разному закисляются: рН в просвете мультивезикулярной части падает до 6,2-5,5, а рН рециркулирующей части возрастает до 6,5.
|
|
|
Среди ранних эндосом выделяют те из них, которые связаны рециркуляцией молекул (рециркулирующие эндосомы), и те, которые превращаются в поздние эндосомы (путь деградации). Рециркуляция имеет разные варианты: молекулы либо возвращаются в ту часть плазмалеммы, откуда были эндоцитированы, либо направляются в иную часть плазмалеммы (базо-латеральная сортировка). Т.е., выделяют отдельно рециркулирующие эндосомы, которые преимущественно состоят из трубчатых структур. Интересно, что и рециркулирующие эндосомы, и поздние, формируются из одной и той же ранней эндосомы.
Несколько кислый рН ранних эндосом (6,3 – 6,8) обеспечивает диссоциацию лиганд-рецепторных комплексов в просвете ранней эндосомы и их сортировку. Тубулярная часть имеет значительную площадь мембран, и здесь накапливаются возвращаемые молекулы, тогда как растворимые компоненты накапливаются в везикулярной части.
|
|
|
Для направления «на деградацию» на молекуле должен быть сигнал. Связывание с убиквитином той или иногрй аминокислоты часто является таким сигналом. Соответственно, сформировавшийся участок может связаться только с определенным участком в везикулярной части эндосомы, где и идет накопление молекул для деградации.
Молекулы для рециркуляции накапливаются в тубулярной части эндосомы или в рециркулирующей эндосоме.
В ранней эндосоме есть также домены, обеспечивающие ретроградный транспорт мембран в транс-сеть АГ.
Таким образом, ранние эндосомы играют очень важную роль в протекании эндоцитоза и связанных с ним процессов, что предполагает высокую точность их работы.
В ранних эндосомах «раздеваются» вирусы, попавшие в клетку путем микроэндоцитоза. Считается, что за счет кислого рН в эндосоме происходит слияние оболочки вируса и мембраны эндосом, при этом вирусный геном оказывается в цитоплазме.
Рециркулирующие эндосомы.
Данная разновидность эндосом представлена тубулярными структурами диаметром около 60 нм, которые контактируют между собой и «общаются» с ранними эндосомами и аппаратом Гольджи посредством пузырькового транспорта.
|
|
|
Маркер - Rabaptin-11
Рециркулирующие эндосомы обеспечивают сортировку как эндоцитированного, так и синтезированного в клетке материала, что особенно важно для поляризованных клеток (эпителий), в которых очень велика разница между белковым составом апикальной и базолатеральной плазмалеммы. Полагают, что из аппарата Гольджи синтезированные компоненты плазмалеммы направляются в рециркулирующие эндосомы, где могут накапливаться, затем – направляться в базо-латрельную мембрану. Рециркулирующие эндосомы таким образом могут выступать в качестве «резерва» плазмалеммы.
Мультивезикулярные тельца
Мультивезикулярные тельца (МВТ) – «поздние эндосомы», содержат многочисленные везикулы (пузырьки) размером 40-100 нм, которые образуются путем инвагинации мембраны эндосомы. Пузырьки называют “intralumеnal vesicles” («пузырьки в просвете»).
МВТ делятся на две разновидности, в зависимости от их основных функций – «деградирующие МВТ», связанные с расщеплением белков цитоплазмы иэндоцитированного материала, и «секретирующие МВТ», связанные с выделением пузырьков из просвета МВТ во внеклеточное пространство.
Формирование внутренних пузырьков МВТ происходит в противоположном эндоцитозу направлении – пузырек не «входит» в цитоплазму, а «выходит» из нее, т.е., мембрана выпячивается (деформируется) в другом направлении. Соответственно, деформирующие мембрану белки – другие. Механизмы формирования внутренних пузырьков не установлены, существует несколько моделей, описывающих формирование пузырьков. Однако, уже ясно, что в клетке работает несколько путей формирования пузырьков, которые обеспечивают их различный состав.
Недавно был идентифицирован молекулярный комплекс в мембране ранних эндосом - «Сортировочный комплекс эндосом, необходимый для транспорта» - ESCRT ( endosomal sorting complex required for transport) - способствует финальным стадиям разделения мембран при формировании мультивезикулярных телец, расхождении делящихся клеток, почковании вирусов. Эти такие различные процессы требуют топологически схожих событий – деформации и разделения мембран для формирования пузырька и его выделения из клетки. Топология этого процесса «противоположна» эндоцитозу, когда пузырек поступает внутрь клетки.
Состоит комплекс из 4 молекулярных комплексов (0–III), которые взаимодействуют между собой и с молекулами цитоплазмы, в том числе - с убиквитином. Последний «отвечает» за сортировку молекул по пути деградации.
Комплекс ESCRT играет важную роль в жизни клетки в связи с его участием в процессе деградации клеточных молекул, захваченных из цитоплазмы при формировании пузырька, – МВТ либо сливаются с существующей лизосомой, либо трансформируются в лизосому. Это определяет важное место МВТ в системе деградации собственных белков и липидов клетки, а не только эндоцитированного материала. Связывание убиквитина с лизином - сигнал, что данная молекул предназначена для деградации. В свою очередь, убиквитин распознается компонентами ESCRT, их несколько, один из них взаимодействует с клатрином.
Комплекс ESCRT, таким образом, обеспечивает формирование внутренних пузырьков МВТ, которые определяют специализацию МВТ в двух направлениях: на выделение пузырьков из клетки («секреторные» МВТ) и в направлении деструкции захваченных из цитоплазмы молекул.
Путь деструкции («разрушающие» МВТ). Один вариант, простой и быстрый – слияние МВТ с уже существующей лизосомой, обладающей полным набором гидролаз в полости. Второй вариант – постепенное «созревание» МВТ тельца и формирование на его основе новой лизосомы.
Ранняя эндосома постепенно превращается в позднюю эндосому (мультивезикулярное тельце), которая не имеет трубчатых выростов. Превращение в позднюю эндосому занимает некоторое время и в его процессе происходит закисление содержимого эндосомы за счет работы протонного насоса V-ATPазы, а также утрата RAB5 и приобретение RAB7 и RAB9, которые вместе с рецептором маннозо-6-фосфата являются маркерами поздних эндосом.
В поздней эндосоме величина рН снижается до 5. «Опушенные» пузырьки из аппарата Гольджи приносят в позднюю эндосому гидролазы, и она становится органоидом, способным разрушать молекулы белков и липидов. В соответствии с существующими представлениями, поздняя эндосома может называться лизосомой, однако, выделяют именно стадию поздней эндосомы, чтобы обозначить процесс наполнения органоида гидролазами.
Поздние эндосомы принимают кислые гидролазы, и возвращают рецептор маннозо-6-фосфата в аппарат Гольджи. Как только последние рецепторы возвращены, поздняя эндосома становится лизосомой. Т.е., лизосома – структура, прекратившая прием новых порций гидролаз. Маркеры поздних эндосом:
1. Rabaptin-7 и Rabaptin-9
2. Lysobisphosphatidic acid (LBPA)
3. MPR+ Рецептор маннозо-6-фосфата
Таким образом, ранние эндосомы, превращаясь в поздние, а затем – в лизосомы, обеспечивают сначала сортировку лигандов, затем - деградацию тех лигандов, которые для этого предназначены.
Лизосомы – клеточные структуры, ограниченные мембраной, функцией которых является разрушение находящихся внутри них молекул и частиц, в том числе - эндоцитированных. Главным отличием лизосом является присутствие в них кислых гидролаз (около 40 видов), способных расщеплять белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Мембрана лизосом устойчива к действию «своих» ферментов благодаря высокому уровню гликозилирования белков с внутренней поверхности мембраны лизосом.
Маркеры лизосом:
- LAMPs+ (lysosomal associated membrane proteins)
- acid hydrolases (кислые гидролазы)
- MPR negative (отсутствует рецептор маннозо-6-фосфата)
- NPC1 (in normal cells)
Таким образом, в клетке существует единая лизосомально-эндосомальная система с четко разграниченными функциями и маркерами. Ранняя эндосома, основное звено системы, постепенно превращается в лизосому. Полагают, что от ранней эндосомы отделяется пузырек с белками, подлежащими деградации, и уже этот пузырек принимает гидролазы и превращается в позднюю эндосому. Механизмы, определяющие «судьбу» МВТ, не установлены.
Ретроградный транспорт из эндосом в АГ обеспечивает возврат мембран и рецептора маннозо-6-фосфата в аппарат Гольджи. Это – очень важный процесс, необходимый для нормальной жизни клетки. В мембране МВТ есть специальные молекулярные структуры, обеспечивающие формирование пузырьков, направляющихся обратно в АГ, и здесь «работает» клатрин.
Экзосомы
Выделение пузырьков из МВТ, сливающихся с плазмалеммой (экзоцитоз), было описано впервые в 1983 г. Harding et al., а термин «экзосомы» был предложен в 1987 г. Johnstone et al. Следующим этапом «истории» экзосом было их выделение из В-лимфоцитов и обнаружение у них антиген-презентирующих характеристик. Затем способность продуцировать экзосомы была показана для многих типов клеток, в том числе - связанных с иммунной системой и канцерогенезом.
В последние годы исследования экзосом носят «взрывной» характер, накапливается все больше подтверждений о том, что они служат передатчиками сигналов между клетками в самых разнообразных процессах. Есть много данных об участии экзосом в канцерогенезе.
Экзосомы найдены во всех биологических жидкостях (плазма крови, моча, слюна, молоко, бронхиальный лаваж и др.).
Экзосомы имеют в электронном микроскопе вид чашки, осаждаются при 100 000 g и имеют плавучую плотность в градиенте сахарозы 1.10–1.21 g/mL. На мембране экзосом экспонируется фосфатидилсерин. Существует три основных метода выделения экзосом: ультрацентрифугирование, ультрафильтрация и иммунопреципитация с использованием антител, связанных с магнитными шариками.
В разных экзосомах на 2010 г. обнаружено 143 вида биологически активных молекул, включая микроРНК и мРНК, что говорит об их способности модулировать экспрессию генов в клетках-мишенях. Исследования в этом направлении ведутся очень активно, существует обширная база данных (ExoCarta Exosome protein and RNA Database (Mathivanan and Simpson, 2009). В экзосомах были найдены разнообразные белки, в зависимости от типа клеток, в том числе – различные цитокины и факторы роста. Многие экзосомы содержат белки главного комплекса гистосовместимости классов I и II.
Ведутся разработки на основе экзосом лекарственных препаратов. Так, экзосомы, полученные из зрелых нагруженных опухолевыми антигенами дендритных клеток, индуцируют у мышей противоопухолевый иммунный ответ, - такой препарат уже находится на стадии клинических испытаний.
Экзосомы обладают неизвестным пока механизмом, обеспечивающим их адресную доставку к клеткам-мишеням. Расшифровка этого механизма даст уникальный инструмент для доставки всевозможных эффекторных молекул и лекарственных веществ в клетки-мишени.
Экзосомы относятся к так называемым «внеклеточным» органеллам» эукариотических клеток, к которым также причисляют «сбрасываемые» микропузырьки (shedding microvesicles) и апоптозные пузырьки (apoptotic blebs). Следует отметь, что в научной литературе нет общепринятой терминологии для обозначения разных видов внеклеточных органелл. Как правило, публикуются данные о смешанных препаратах, и путаницы очень много. Важно уяснить, что стоит за каждым из терминов в конкретной статье, и тогда можно будет понять, о чем идет речь в публикациях. Главное – механизм образования внеклеточных мембранных пузырьков.
Микропузырьки ( Shedding microvesicles ) – мембранные пузырьки размером более 100 нм (до 1 мкм), которые образуются на плазматической мембране многих клеток. В процессе их формирования происходит выпячивание отростка цитоплазмы наружу и отшнуровка пузырька. Фактически имеет место не пузырек, а «кусочек» клетки. В регуляцию этого процесса вовлечены ферменты calpain, flippase, floppase, scramblase и gelsolin. В микропузырьках, продуцируемых тромбоцитами, присутствуют липидные рафты. Микропузырьки обнаружены во всех исследованных биологических жидкостях и, как и экзосомы, также активно изучаются.
Апоптозные «пузырьки» формируются на плазматической мембране клеток, претерпевающих апоптоз. Считается, что они должны содержать фрагменты распавшегося ядра, являясь фактически «останками» конденсированных разрушающихся клеток. Само выделение этих структур в отдельную категорию выглядит неоднозначным. Давно существует понятие «апоптозные» тельца для обозначения фрагментов распавшихся в результате апоптоза клеток. Детали апоптоза будут нами рассмотрены позднее.
В процессе апоптоза образуются и микропузырьки, но на его ранних стадиях. Апоптозные «пузырьки» (50-500 нм) формируются на поздних стадиях апоптоза. Следует подчеркнуть, что и микропузырьки, и апоптозные «пузырьки» гетерогенны по размерам и форме, в отличие от экзосом, имеющих одинаковую форму.
В настоящее время публикуется множество статей, посвященных изучению экзосом и микропузырьков, и при их анализе нужно, прежде всего, определить, о каком виде структур идет речь.
СТРУКТУРЫ, СВЯЗАННЫЕ С ПЛАЗМАЛЕММОЙ
Плазмалемма – зона контакта клетки с окружающей средой и имеет ряд специализированных структур, связанных с осуществлением ее «пограничных» функций.
Гликокаликс . Нежная опушка на поверхности плазмалеммы. Есть всегда, но не всегда выявляется на электронограммах – нужна соответствующая обработка. Гликокаликс образован углеводными частями молекул, формирующих мембрану. Гликолипиды составляют около 2% липидов мембраны. Гликопротеины.
Функции гликокаликса:
- защита клеточной поверхности
- межклеточные взаимодействия.
Гликокаликс заполняет пространство между клетками в тканях, соответственно, принимает участие во всех процессах на поверхности клеток.
Лейкоциты и эндотелий – пример работы молекул гликокаликса.
Выход лейкоцитов за пределы кровеносного русла – для осуществления защитных функций. Сначала – адгезия лейкоцитов на поверхности эндотелия. Именно эта стадия опосредуется взаимодействием трансмембранных гликопротеинов лейкоцитов и эндотелия, в котором важную роль играют углеводные компоненты молекул, формирующие гликокаликс. Эти белки называются селектинами. Селектины эндотелия (Е и Р) распознают лейкоциты и взаимодействуют с селектинами лейкоцитов (селектин L).
Внеклеточный матрикс
Внеклеточный матрикс – у животных клеток – слой молекул, тесно прилежащих к клетке, связанных с ее поверхностью. В составе матрикса в основном – белки и полисахариды. Его роль – формирование структуры тканей, связывание клеток друг с другом, участие в регуляции жизнедеятельности клеток, поддержание контактов и пр.
Основные клеточные рецепторы, обеспечивающие взаимодействие клетки с внеклеточным матриксом – интегрины.
Интегрины – семейство трансмембранных белков. Снаружи клетки они связываются с различными молекулами внеклеточного матрикса, а внутри клетки – с белками цитоскелета.
Одним из примеров структурно организованного внеклеточного матрикса является базальная мембрана, подстилающая слои эпителия и окружающая нервные и мышечные клетки.
Доля внеклеточного матрикса в тканях различна. В рыхлой соединительной ткани матрикс составляет основную часть, и содержит коллагеновые волокна. В хряще внеклеточный матрикс составляет основную массу ткани.
Клеточная стенка (оболочка).
Клеточную стенку, структурно оформленную, имеют многие бактерии, а также грибы, водоросли и высшие растения.
Стенка (капсула) бактерий защищает их от внешних влияний. Ряд бактерий имеет достаточно жесткую клеточную стенку, которая защищает их от неблагоприятных условий внешней среды. Состав стенки различается, она может быть образована единственным белком (S-слой). Основным компонентом клеточной стенки бактерий являются пептидогликаны, состоящие из линейных полисахаридов, соединенных короткими пептидными мостиками. Т.е., клеточная стенка бактерий – оболочка, сформированная прочными ковалентными связями, и генетически запрограммированная.
Клеточная стенка – объект атаки некоторых антибиотиков. Пенициллин, например, ингибирует фермент, ответственный за формирование пептидных сшивок между углеводными нитями пептидогликанов.
Грам-положительные и Грам-отрицательные микроорганизмы. Окраска выявляет наличие клеточной стенки – грам-отрицательные микробы не прокрашиваются, стенка не пропускает краситель. На уровне электронной микроскопии: у Гр+ бактерий – одна мембрана, у Гр - - две. Мембраны разделены периплазматическим пространством. Прилежащая к цитоплазме и допонительная мембрана различаются по составу.
Грам- - кишечная палочка.
Дата добавления: 2022-01-22; просмотров: 21; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!