Метод посева уколом в полужидкий агар.
Микробиология. Лабораторная работа №4. МПД 20.
ТЕМА: Методы определения подвижности микроорганизмов.
Цель работы: ознакомиться с методами определения подвижности микроорганизмов.
Материалы и оборудование: предметные и покровные стекла, микроскопы, иммерсионное масло, спиртовки, спички, пробирки со скошенным агаром, пробирки с полужидким агаром, культуры микроорганизмов, бактериологические петли, бактериологические иглы, термостат, фильтровальная бумага, дистиллированная вода.
Ход работы:
Определение подвижности бактерий методом «висячая капля».
Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые.
Методом Шукевича.
Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).
|
|
|
Метод «раздавленная капля».
Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».
Метод посева уколом в полужидкий агар.
Для этого бактериологической петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.
Вопросы для самоконтроля:
Почему для исследования жгутиков бактерий используют бактерии в живом состоянии?
Чем отличается перитрих от лофотриха?
В чем суть метода Шукевича?
Как определить подвижность бактерий при посеве уколом в полужидкий агар?
Теоретические пояснения:
Подвижность бактерий важный видовой признак и производится при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков - специальных тонких нитевидных образований. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют :
|
|
|
а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас);
б) лофотрихи - микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);
в) амфитрихи - микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;
г) перитрихи - микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки (E. coli).
Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки. Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.
|
|
|
Жгутики являются органами движения у отдельных представителей прокариот. Подвижность бактерий может обеспечиваться различным образом. Двигаться без жгутиков способны скользящие бактерии (к которым относятся миксобактерии, цианобактерии) и спирохеты. По характеру движения подвижные бактерии разделяются на плавающие и скользящие (ползающие). Орган движения плавающих бактерий — жгутики; подвижность скользящих бактерий обеспечивают волнообразные сокращения тела.
Расположение жгутиков — характерный признак, имеющий таксономическое значение. У палочковидных бактерий жгутики могут прикрепляться полярно или латерально.
Монотрихи (от греч. mono — один + trichos — волос) — бактерии содержат один жгутик (Vibrio); перитрихи — (от греч. реп — вокруг + trichos — волос) — жгутики расположены по всей поверхности клеточной стенки (Proteus); лофотрихи (от греч. lophos — пучок + trichos — волос) — имеют монополярно политрихиальное (Pseudomonas) расположение пучка жгутиков на одном конце клетки; амфитрихи (от греч. amphi — двусторонний + trichos — волос) — бактерии с пучком жгутиков на обоих концах (Spirillum).
|
|
|
Число жгутиков различно у разных видов бактерий: спириллы имеют от 5 до 30, вибрионы — 1—3 на полюсе клетки, а протеи и клостридии — от 50 до 100 жгутиков. Перитрихиально расположенные жгутики работают как один хорошо скоординированный спиральный пучок и проталкивают клетку через среду. Чтобы обнаружить жгутики при обычном увеличении микроскопа, прибегают к протравливанию препарата с целью увеличения диаметра жгутиков, а лучше наблюдать с помощью электронного микроскопа. В среднем диаметр жгутика — 13 нм (до 20 нм), длина у некоторых достигает до 20—30 мкм, во много раз превышая длину самой бактерии. Бактерии, снабженные жгутиками, могут передвигаться очень быстро: Bacillus — со скоростью 1,6 мм/мин, Vibrio — 12 мм/мин; это соответствует примерно от 300 до 3000 длин тела в минуту. Подвижность бактерий выявляют микроскопией препаратов в висячей капле. Характер движения бактерий зависит от расположения жгутиков и частично от формы тела. Бактерии, у которых жгутики находятся на одном конце тела, движутся обычно по прямой линии, совершая иногда легкие колебательные движения. У перитрихов движение сопровождается оживленным кувырканием клетки в разные стороны. Жгутики вращаются сравнительно быстро: например, у спирилл они совершают около ЗОООоб/мин.
Жгутики не являются жизненно важной структурой для бактериальной клетки, но являются видовым признаком. Подвижностью обладают извитые формы бактерий, палочковидные формы — не все, шаровидные формы — неподвижны, за исключением некоторых видов, например Sarcina игеае. Активное движение бактерий — поступательное; жгутики проталкивают клетку подобно корабельному винту, они перегоняют друг друга в разных направлениях и с разной скоростью. Движения бактерий не следует смешивать с чисто механическим перемещением с током жидкости в одном направлении и с одинаковой скоростью или с молекулярным беспорядочным движением взвешенных частиц (броуновским движением). Жгутики могут спонтанно или в ответ на внешний стимул изменять направление вращения. Это приводит к тому, что клетка начинает двигаться вспять. Скорость обратного движения в 4 раза меньше скорости поступательного движения.
Наличие жгутиков зависит от условий внешней среды. На твердых средах при длительном выращивании культуры у бактерий жгутики могут исчезать, а на жидких — вновь появляться. Бактерии теряют жгутики и во время образования спор. На подвижность бактерий влияет присутствие в среде наркотических веществ, ядов, продуктов жизнедеятельности клетки, слишком низкие или высокие температуры.
Строение жгутика. Жгутики представляют собой полужесткие спиралевидные роторы, приводящие клетки во вращательное движение благодаря подвижному прикреплению ^-кольца к внутренней поверхности клеточной стенки и фиксации М-кольца в клеточной мембране. Вращение ?-кольца относительно фиксированного Л/-кольца обеспечивает жгутику вращательное движение. Кольца как бы играют роль «приводного диска» и подшипника. Вся конструкция выполняет функцию хемомеханического преобразователя (флагеллиновый мотор). У спирохет за движение ответственна особая органелла — осевая нить, состоящая из двух рядов бактериальных нитей, расположенных продольно внутри клетки. Причина движения У-кольца окончательно не выяснена.
Нити жгутиков состоят из специфического белка флагеллина. Место прикрепления жгутика имеет сложное строение и состоит из базальной структуры (или базального тельца) и «крюка».
С помощью базального тельца жгутик закреплен в плазматической мембране и в клеточной стенке. Оно состоит из центрального стержня, на котором у грамотрицательных бактерий находятся две пары колец. Наружная пара (кольца L и Р) расположена на уровне наружного и внутреннего слоев клеточной стенки, а внутренняя пара (кольца S и М) — на уровне наружного слоя плазматической мембраны. У грамположительных бактерий наружная пара колец отсутствует, что послужило предположением, что для вращения жгутиков необходима только внутренняя пара.
Крюк — это структура, находящаяся в основании филамента, обычно он изогнут углом или плавно. Наружный диаметр крюка несколько превышает диаметр филамента; общая длина его — около 900 нм. Функция крюка еще не вполне понятна, хотя можно предполагать, что он играет роль гибкого сочленения, обеспечивая эффективную передачу движения от базального тела к филаменту и одновременно придавая структуре филамента устойчивость по отношению к изменениям в окружающей среде. Стержень, выходящий из проксимального конца крюка, проходит сквозь клеточные оболочки и соединяется с базальными структурами.
Базальное тело — это сложная структура, ответственная не только за прикрепление жгутика к бактериальной клетке, но также и за создание движения. Исследование его ультраструктуры показало, что у грамотрицательных бактерий (т.е. у бактерий, которые имеют наружную липополисахаридную мембрану и слой пептидогликанов внутри клеточной стенки) в базальном теле есть четыре кольца, почти одинаковых по диаметру. Самое нижнее, или кольцо М(membrane), прикреплено к цитоплазматической мембране, и из него выходит стержень жгутика. Кольцо S (supermembrane) расположено как раз над цитоплазматической мембраной и, по-видимому, не соединено ни с какими другими клеточными структурами. Остальные два кольца — Р (от peptidoglycan, т.е. на уровне пептидогликанового слоя) и L (от lipopolysaccaride, т.е. на уровне липополисахаридной мембраны) — погружены в соответствующие слои клеточной стенки; они фиксируют стержень, проходящий сквозь бактериальную стенку.
У грамположительных бактерий (например, В. subtilis) базальное тело имеет сходную структуру, но несколько упрощенную по сравнению с грамотрицательными бактериями. В нем имеется только одна пара колец, расположенных у основания стержня и, по-видимому, аналогичных кольцам S и М у Е. coir, их обозначают соответственно теми же буквами. У В. subtil is кольцо М находится в цитоплазматической мембране, а кольцо S прикреплено к внутренней части пептидогликанового слоя, где оно, вероятно, контактирует с молекулами тейхоевых кислот.
Некоторые перитрихи могут перемещаться по поверхности агара, т.е. плавающие бактерии способны к передвижению по поверхности твердых сред. Так, Proteus vulgaris распространяется по поверхности агара, образуя тонкий серый налет (напоминающий таковой при выдохе на холодное стекло), а неподвижные штаммы протея лишены такой особенности. Это явление получило название «феномен роения», а наблюдение за ним легло в основу некоторых понятий бактериальной серодиагностики. Антигены поверхности, или вообще тела клетки (соматические) называют
О-антигенами (от нем. Ohne Hauch — без налета, О-форма), а антигены жгутиков — Я-антигенами (от нем. Hauch — налет, Я-форма).
Способность бактерий к целенаправленному движению генетически обусловлена. Например, у Е. coli в регуляции этого процесса вовлечено 3% генома (приблизительно 50 генов). Эти гены кодируют белки, образующие локомоторный (двигательный) аппарат, а также белки и ферменты, участвующие в преобразовании сигналов. Для жгутикового аппарата характерна периодическая изменчивость. Во многом этот процесс носит адаптивный характер и наиболее выражен у патогенных микроорганизмов.
Рассмотреть жгутики у бактерий под обычным световым микроскопом невозможно, так как их малые размеры лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Обнаруживают жгутики у бактерий различными способами. Строение их и другие детали изучаются методом электронной и фазово-контрастной микроскопии. Расположение и количество жгутиков можно рассмотреть под световым микроскопом, применяя «сверхокраску» по методу Леффлера. Сложность и недоступность этих методов исключает их использование в условиях практических лабораторий. По расположению жгутиков подвижные микробы условно разделяют на 3 группы.
1. Монотрихи – бактерии с одним жгутиком на конце.
2. Лофотрихи – бактерии с пучком жгутиков на одном конце.
3. Перитрихи – бактерии со жгутиками по всей поверхности тела.
Практически изучение микробов в живом состоянии применяется для определения подвижности, то есть косвенного подтверждения наличия жгутиков. Движение микробов можно наблюдать в препаратах «раздавленная капля» или «висячая капля». Микроскопируют эти препараты сухим или иммерсионным объективом. Лучшие результаты получают при микроскопировании в темном поле зрения.
Вопросы для самоконтроля:
1. Почему для исследования жгутиков бактерий используют бактерии в живом состоянии?
2. Чем отличается перитрих от лофотриха?
3. В чем суть метода Шукевича?
4. Как определить подвижность бактерий при посеве уколом в полужидкий агар?
Цель работы: ознакомиться с методами определения подвижности микроорганизмов.
Ход работы:
Определение подвижности бактерий методом «висячая капля».
Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой. Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые.
Методом Шукевича.
Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).
Метод «раздавленная капля».
Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».
Метод посева уколом в полужидкий агар.
Для этого бактериологической петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная - только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.
Вопросы для самоконтроля:
Дата добавления: 2021-12-10; просмотров: 140; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!