Механизм полимеразной цепной реакции

Практическое занятие № 6.

Дифференциация микроорганизмов по морфологическим свойствам: нормальная микрофлора тела человека. Работа с микроскопом: изучение морфологических свойств микроорганизмов – представителей нормальной микрофлоры. Изучение препаратов пробиотиков. Современная диагностика дисбактериоза и дисбиоза методом ПЦП. Работа с бланками анализов на дисбактериоз.

Цель: научиться методам определения микрофлоры организма человека.

Задачи:

Личностные УУД:

1. Усвоить значение нормальной микрофлоры в жизнедеятельности человека;

2. Уметь оценить результаты методов определения микрофлоры различных органов и полостей организма человека.

3. Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес.

4. Организовывать собственную деятельность, выбирать типовые методы и способы выполнения профессиональных задач, оценивать их эффективность и качество.

5. Принимать решения в стандартных и нестандартных ситуациях, нести за них ответственность.

6. Осуществлять поиск, и использование информации, необходимой для эффективного выполнения профессиональных задач, профессионального и личностного развития.

7. Использовать информационно-коммуникационные технологии в профессиональной деятельности.

Коммуникативные УУД:

Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством, потребителями.

Регулятивные УУД:

1. Целеполагание;

2. Планирование;

3. Прогнозирование;

4. Контроль;

5. Коррекция;

6. Оценка;

7. Волевая саморегуляция.

Воспитательные УУД:

1. Воспитание в студентах ответственность за свою жизнь и жизнь окружающих;

2. Профилактика вредных привычек и правонарушений.

Актуализация знаний – 30 минут.

Практическая работа.

При изучении микрофлоры тела человека останавливается на микрофлоре кожи и слизистых оболочек, полости рта, желудочно-кишечного тракта, мочеполовых органов, дыхательной системы. При разборе микрофлоры полости рта следует обратить внимание на причины обильного заселения микроорганизмами этого биотопа. При изучении микрофлоры ЖКТ студентам надо знать, в каких отделах особенно много микробов и почему. При разборе микрофлоры дыхательных путей обращает внимание на то, какие отделы в норме микробы заселяют, а какие нет. Подробно останавливаются на формирование и значении микрофлоры человека в норме и патологии. Обращает внимание на понятие «дисбактериоз» и условия его развития и профилактики.

Задание 1.

Посмотреть под микроскопом Мазок зубного налета. Окраска по Грамму. Зарисовать в тетради результаты.

Задание 2. Приготовление смывов.

Для получения смывов пользуются стерильными ватными тампонами, которые перед употреблением смачивают в стерильном физиологическом растворе. Увлажненный тампон дают в руки обследуемому, предлагая протереть им обе руки, тщательно протирая ладони, межпальцевые промежутки и подноготные пространства. По окончании процедуры тампоны помещают в пробирку с физиологическим раствором, где они находились.

Смывы с поверхности предметов, имеющих большую поверхность, исследуемый участок ограничивают рамкой-трафаретом площадью 25 см². При исследовании мелких предметов смыв делают со всей поверхности.

Затем тампон помещают в пробирку со стерильным физраствором, выдерживают там 5-10 минут и хорошо отмывают. При необходимости из исходного раствора готовят ряд последовательных десятикратных разведений. Затем в стерильную пустую чашку Петри вносят 1 мл раствора из пробирки и заливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 45°C МПА. Посевы выдерживают в термостате при 37°С в течение суток и 24 ч при комнатной температуре, после чего подсчитывают количество выросших колоний с учетом разведений.

Устанавливают количество микроорганизмов в 1 мл исходного разведения смыва, определяют количество микроорганизмов в 10 мл смыва, соответствующее общему числу микроорганизмов, находящихся на той площади, с которой произведен смыв и количество микроорганизмов на 1 см² исследуемой поверхности (для этого величину, характеризующую количество микроорганизмов в 1 мл смыва, делят на число квадратных сантиметров, с которых сделан смыв).

Для выявления бактерий группы кишечной палочки можно пользоваться прямым посевом исследуемого материала на чашки со средой Эндо, для этого поверхность плотной питательной среды тщательно протирают исследуемым тампоном.

Задание 3. ПЦР – метод.

Совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взаимосвязями и местом обитания, составляет нормальную микрофлору человека. Нормальная микрофлора рассматривается как самостоятельный экстракорпоральный орган с определенной анатомической структурой и функциями. Виды нормальной микрофлоры: - резидентная – постоянная (естественная) – представлена относительно стабильным составом микроорганизмов, обычно обнаруживаемых в определенных местах тела человека определенного возраста; после нарушений состав этой флоры быстро восстанавливается; - транзиторная – временно попавшая, не характерна для данного биотопа; попадает на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывая заболеваний. Она представлена непатогенными, т.е. сапрофитными или потенциально патогенными (условно-патогенными) микроорганизмами. Нормальная микрофлора формируется с рождения. На ее формирование оказывают влияние микрофлора матери и внутрибольничной среды, характер вскармливания.

Дисбактериоз (дисбиоз) – любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормальной микрофлоры человек, возникающие в результате воздействия на макро- или микроорганизм различных неблагоприятных факторов.

Микробиологическими показателями дисбиоза служат: 1) снижение численности одного или нескольких постоянных видов; 2) потеря бактериями тех или иных признаков или приобретение новых; 35 3) повышение численности транзиторных видов; 4) появление новых, несвойственных данному биотопу видов; 5) ослабление антагонистической активности нормофлоры. Лабораторная диагностика дисбактериоза: основной метод – бактериологическое исследование, дополнительный – хроматография жирных кислот в исследуемом материале. Каждому роду бактерий соответствует свой спектр жирных кислот. С отдельных участков тела человека делают мазок и изучают содержащиеся микроорганизмы. Лечение дисбиоза должно быть комплексным и направленным в основном на устранение причин дисбактериоза и восстановление нормофлоры. При дисбактериозе проводится коррекция состава микрофлоры с помощью: а) эубиотиков – препараты, содержащие живые бактерициногенные штаммы нормальной микрофлоры (колибактерин, бификол, бифидумбактерин); б) пробиотиков – вещества немикробного происхождения и продукты питания, содержащие добавки, стимулирующие собственную нормальную микрофлору (олигосахариды, муцин, лактоферин).

Лабораторная диагностика дисбактериоза: основной метод – бактериологическое исследование, дополнительный – хроматография жирных кислот в исследуемом материале. Каждому роду бактерий соответствует свой спектр жирных кислот. С отдельных участков тела человека делают мазок и изучают содержащиеся микроорганизмы. Лечение дисбиоза должно быть комплексным и направленным в основном на устранение причин дисбактериоза и восстановление нормофлоры. При дисбактериозе проводится коррекция состава микрофлоры с помощью: а) эубиотиков – препараты, содержащие живые бактерициногенные штаммы нормальной микрофлоры (колибактерин, бификол, бифидумбактерин); б) пробиотиков – вещества немикробного происхождения и продукты питания, содержащие добавки, стимулирующие собственную нормальную микрофлору (олигосахариды, муцин, лактоферин).

ПЦР – исследование:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – процесс амплификации фрагмента ДНК in vitro с помощью ДНК полимеразы, осуществляющей синтез ДНК на двух взаимно комплементарных матрицах. Основной активностью ДНК-полимераз является наращивание (элонгация) нуклеотидной цепи, комплементарной матричной. Такая реакция легко воспроизводится in vitro. ДНК-полимераза способна достраивать недостающую цепь на одноцепочечной ДНК, используя в качестве затравки короткий фрагмент ДНК, связанный (гибридизовавшийся) с одноцепочечной матрицей. Такой короткий одноцепочечный фрагмент, комплементарный участку матричной молекулы ДНК и используемый для инициации элонгации нуклеотидной цепи ДНК-полимеразой, называют праймером. Обычно при проведении ПЦР используют праймеры длиной от 20 до 30 нуклеотидов. Для осуществления ПЦР необходимы два праймера, с тем расчетом, чтобы они связывались с обеими цепями ДНК, ограничивая амплифицируемый фрагмент. Его длина обычно составляет около 500–2000 п.н., хотя можно достичь амплификации фрагмента до 10 000 п.н. Чтобы провести ПЦР, в специальной пробирке смешивают буфер, матричную ДНК, праймеры, дНТФ и термостабильную ДНК-полимеразу. Существует большое количество буферов для ПЦР. Как правило, используют те, которые рекомендуются и поставляются производителем полимеразы. В любом буфере существенной является концентрация ионов магния, поскольку от нее зависит активность полимеразы и ее специфичность. Она также влияет на Tm ДНК. Концентрация ионов магния может варьировать в пределах от 0,5 до 5,0 ммоль/л, однако чаще используют концентрацию 1,5–2,5 ммоль/л. Повышение концентрации магния ведет к неспецифической амплификации, недостаток – снижает активность полимеразы. Один цикл ПЦР состоит из 3 этапов (см. рис. 1): 1. Денатурация (плавление) матричной ДНК под действием высокой температуры. 2. Связывание (гибридизация или отжиг) праймеров с матричной ДНК. 3. Элонгация (наращивание) цепи.

Механизм полимеразной цепной реакции

Смена этапов цикла обеспечивается изменением температуры реакционной смеси. Для этого используют специальные приборы – термоциклеры, или амплификаторы. Денатурацию проводят при температуре 94–95° С. Понижение температуры до 93° С приводит к неполной денатурации и невозможности осуществления ПЦР, повышение до 96° С и выше – к быстрому разрушению фермента. Перед осуществлением ПЦР проводят первоначальную денатурацию матричной ДНК при температуре 94–95° С в течение 4–10 мин. Для связывания праймеров температуру понижают, чаще всего до 40–60° С. Однако точный выбор температуры связывания производят исходя из температуры плавления праймера и степени его комплементарности матрице. Повышение температуры, при которой проводится связывание, выше температуры плавления праймера резко снижает эффективность ПЦР или делает ее невозможной. Если праймер не на 100% комплементарен матрице, осуществление ПЦР возможно при понижении температуры связывания в случае, если нуклеотиды 3´ конца праймера полностью соответствуют матрице. Элонгацию чаще всего проводят при 72° С. Поскольку ДНК полимераза из E.coli при высокой температуре будет денатурирована, для ПЦР используют полимеразы термофильных микроорганизмов, чаще всего Taq-полимеразу, первоначально выделенную из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Оптимум активности Taq-полимеразы находится в области 75° С. Кроме того, Taqполимераза позволяет амплифицировать достаточно протяженные последовательности (4–10 т.п.н.). Следует отметить, что часто температуру элонгации уменьшают до 65° С при увеличении ее продолжительности, или же проводят в 2 этапа – сначала при пониженной температуре, а затем при 72° С. Необходимость этого может быть обусловлена низкой температурой плавления праймера или же низкой температурой плавления амплифицируемого участка. Циклы полимеразной реакции повторяют многократно (обычно 20–40 раз), после чего проводят завершающую элонгацию, продолжительность которой увеличена. Теоретически каждый цикл приводит к удвоению количества амплифи- 7 цируемого фрагмента, так как в качестве матрицы используются как старые, так и вновь синтезированные фрагменты. Таким образом, увеличение количества ДНК происходит в геометрической прогрессии. За 20 циклов реакции можно увеличить количество фрагмента ДНК в 220 раз, т.е. приблизительно в 1 000 000 раз. Длинные (не ограниченные с одной стороны) копии будут синтезироваться только с исходных родительских цепей – 20 копий за 20 циклов, что пренебрежимо мало по сравнению с количеством основного продукта. Увеличение количества амплифицируемой ДНК в геометрической прогрессии обуславливает высокую чувствительность реакции. Для проведения ПЦР необходимо крайне малое количество матричной ДНК – может быть достаточно 1 молекулы. Такая чувствительность ПЦР предъявляет особые требования к чистоте материалов, применяемых при ее проведении. Все компоненты должны быть стерильными и свободными от посторонней ДНК. При этом нет абсолютной необходимости в очистке матричной ДНК, так как специфичность амплификации обеспечивается специфичностью праймеров. Поэтому при проведении типирования бактерий возможно использование упрощенных методов лизиса. Это позволяет существенно снизить затраты материалов, труда и времени. Один из наиболее простых и удобных методов подготовки образца – лизис бактериальных клеток путем их замораживания и оттаивания.

Культуру бактерий выращивают в подходящей жидкой среде или на поверхности агара (рассев до единичной колонии). Если использовалась жидкая среда, то клетки отмывают дистиллированной водой или буфером, а затем ресуспендируют в стерильной дистиллированной воде. Культуру, выросшую на твердой среде сразу же ресуспендируют в стерильной дистиллированной воде (1–2 колонии на 100 мкл). Суспензию замораживают и хранят до использования при – 20° C. В реакционную смесь добавляют 1–2 мкл оттаявшей суспензии (104 –106 клеток). При использовании упрощенных методов получения матрицы следует учитывать, что добавление избыточных количеств неочищенного лизата может привести к ингибированию реакции.

Дата добавления: 2021-12-10; просмотров: 62; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

12 Следующая ⇒

Мы поможем в написании ваших работ!