Реакции антиген-антитело и их применение
Государственное автономное образовательное учреждение
Среднего профессионального образования Республики Крым
«Евпаторийский медицинский колледж»
План занятия (теоретическое) № 20
Тема занятия: Иммунодиагностика.
Специальность: 31.02.03.«Лабораторная диагностика»
Курс 1-ый
Дисциплина (МДК) 04.01. Теория и практика лабораторных микробиологических и иммунологических исследований
Образовательные:
· Сформировать профессиональные знания о иммунологических процессах и функциях в организме человека
· Изучить методы диагностики при помощи иммунобиологических препаратов
Ход занятия
https://www.youtube.com/watch?v=OaNPA55oGZo
Иммунный статус макроорганизма. Методы оценки.
Состояние иммунной системы имеет важнейшее значение в обеспечении гомеостаза организма, защите от всего генетически чужеродного.
Иммунный статус определяет эффективность и согласованность работы всех систем и звеньев иммунитета - макрофагов, комплемента, интерферонов, Т- и В- лимфоцитов, главной системы гистосовместимости. Раздел медицины, изучающий патологию человека в аспекте нарушений функций иммунной системы, называется клинической иммунологией.
Для постановки диагноза иммунопатологического состояния проводят сбор иммунологического анамнеза и постановку иммунологических тестов. Могут также осуществляться тесты in vivo (кожные тесты), ретгенологическое исследование лимфоидных органов (тимуса).
|
|
|
При опросе определяют наиболее вероятный иммунопатологический синдром, среди которых основными являются шесть:
-инфекционный синдром;
- аллергический синдром;
- аутоиммунный синдром;
- первичный иммунодефицит;
- вторичный иммунодефицит;
- иммунопролиферативный синдром.
Для оценки общего иммунного статуса используют наиболее простые и достоверные показатели, отражающие суммарную эффективность работы всех систем иммунитета, для изучения уязвимого звена - специфичные для каждой системы дифференциальные тесты. Следовательно, изучение иммунного статуса проводится не менее чем в два этапа. Р.П.Петров с соавторами в 1984г. создали двухэтапный подход к оценке иммунного статуса, в соответствии с которым лабораторные иммунологические тесты разделены на тесты первого и второго уровня.
На первом этапе с помощью простых ориентировочных методов выявляют “грубые” дефекты фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета. К тестам первого уровня относят :
- определение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов в периферической крови;
|
|
|
- определение количества Т- и В- лимфоцитов;
- определение уровня иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgM, IgA);
- определение фагоцитарной активности лейкоцитов;
- определение титра комплемента (не обязательно).
С учетом анализа результатов тестов 1 уровня определяют дальнейшую тактику иммунологического исследования.
Более тщательный и глубокий анализ состояния иммунной системы проводят с помощью тестов второго уровня - аналитических методов. К ним можно отнести методы оценки функциональной активности Т- и В- лимфоцитов, фагоцитов, вспомогательных клеток, естественных киллеров, компонентов системы комплемента и многих других.
Методы исследования главных компонентов иммунной системы принято делить также на скрининговые и развернутые.
При оценке В- системы иммунитета к скрининговым тестам относятся : определение количества CD19+ и CD20+ клеток, IgG, IgM и IgA, а также IgG1,2,3,4, к развернутым- бласттрансформацию на митоген лаконоса и S.aureus, пповерхностных маркеров В- лимфоцитов.
При оценке Т- системы иммунитета к скрининговым методам можно отнести кожные тесты на бактериальные антигены, определение поверхностных маркеров Т- лимфоцитов CD3, CD4, CD8, бласттрансформацию на фитогемагглютинин, к развернутым- изучение продукции цитокинов, активационных маркеров, Т- клеточных рецепторов.
|
|
|
При оценке фагоцитоза к скрининговым тестам относят определение количества нейтрофилов, изучение их морфологии и образования активных форм кислорода, к развернутым- определение киллинга микробов, лизосомальных ферментов, цитокинов.
Существующие методы оценки иммунного статуса постоянно совершенствуются, однако есть ряд общих правил, которых необходимо придерживаться при оценке иммунограмм :
- комплексный анализ, а не оценка одного показателя;
- анализ в комплексе с клиническими и анамнестическими данными;
- оценка резких сдвигов показателей (не менее 20% от нормы);
- анализ в динамике;
- анализ не только (и не столько) абсолютных данных, а соотношений показателей (особо- индекс Th/Ts);
- учет возможных индивидуальных особенностей (возраст, сопутствующие заболевания) и колебаний показателей (физиологических и патологических- прием пищи, физические нагрузки, время суток, действие стрессоров и т.д.);
- учет региональных норм;
- учет материально- технической базы лаборатории. На вооружении современной лаборатории- проточные цитометры и другое оборудование, которое позволяет наиболее точно и подробно определить иммунный статус (лазерная проточная цитофлюориметрия).
|
|
|
Методы исследования лимфоцитов можно разделить на изучение поверхностных маркеров и функциональные тесты.
Изучение поверхностных СД антигенов основывается на :
- методах розеткообразования;
- методах иммунофлюоресценции;
- иммуноферментном анализе.
Для определения количества Т- клеток чаще используют метод розеткообразования с эритроцитами барана. Метод основан на родстве рецептора CD2 с белками мембраны эритроцитов барана. При смешивании лимфоцитов с эритроцитами барана образуются фигуры в виде розеток. Количество розеткообразующих клеток (Е- РОК) соответствует количеству Т- лимфоцитов (CD2+ клеток).
Для определения количества В- клеток используют EAC- розетки. Лимфоциты смешивают с эритроцитами быка, обработанными комплементом и антителами к эритроцитам.
Важнейшее значение имеет вычисление индекса CD4/CD8 (хелперно- супрессорного отношения). Необходимо учитывать, что нет единого метода для оценки Т- хелперов и Т- супрессоров.
CD8+ несут Т- супрессоры и Т- киллеры, часть NK- клеток.
CD4+ несут Т- хелперы и Т- индукторы, моноциты, эффекторы- Т- клетки ГЗТ.
Поэтому оценку Ts и Th осуществляют также в теофиллиновом тесте. Т- супрессоры в присутствии теофиллина теряют способность к Е- розеткообразованию (теофиллин- чувствительные Т- лимфоциты), Т- хелперы теофиллин- резистентны. Оценивают также субпопуляции Т- лимфоцитов с рецепторами для Fc фрагмента : IgM (Т мю) и IgG (Т гамма). Т- гамма это преимущественно хелперы, Т мю - супрессоры.
К функциональным тестам относят методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов на Т- и В- митогены (РБТЛ- реакция бластной трансформации лимфоцитов), продукции антител, синтеза мононуклеарами цитокинов (особо!).
Реакции антиген-антитело и их применение
При введении антигена в организме образуются антитела. Антитела комплементарны антигену, вызвавшему их синтез, и способны с ним связываться. Связывание антигенов с антителами состоит из двух фаз. Первая фаза - специфическая, при которой происходит быстрое связывание антигенной детерминанты с активным центром Fab-фрагмента антител. Следует отметить, что связывание обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными и гидрофобными взаимодействиями. Прочность связи определяется степенью пространственного соответствия активного центра антитела и эпитопа антигена. После специфической фазы наступает более медленная - неспецифическая, которая проявляется видимым физическим явлением (например, образованием хлопьев при агглютинации и др.).
Иммунные реакции - это взаимодействие между антителами и антигенами, причем эти реакции специфичны и обладают высокой чувствительностью. Они широко используются в медицинской практике. С помощью иммунных реакций можно решить следующие задачи:
• определение неизвестных антител по известным антигенам (антигенный диагностикум). Такая задача стоит, когда необходимо определить в сыворотке крови больного антител к возбудителю (серодиагностика). Нахождение антител позволяет подтвердить диагноз;
• определение неизвестных антигенов по известным антителам (диагностическая сыворотка). Это исследование проводят при идентификации культуры возбудителя, выделенной из материала больного (серотипирование), а также при обнаружении
антигенов микробов и их токсинов в крови и других биологических жидкостях. Существует много разновидностей иммунных реакций, различающихся по технике постановки и регистрируемому эффекту. Это реакции агглютинации (РА), преципитации (РП), реакции с участием комплемента (РСК), реакции с использованием меченых компонентов (РИФ, ИФА, РИА).
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации (РА) - это иммунная реакция взаимодействия антигена с антителами в присутствии электролитов, причем антиген находится в корпускулярном состоянии (эритроциты, бактерии, частицы латекса с адсорбированными антигенами). При агглютинации происходит склеивание корпускулярных антигенов антителами, что проявляется образованием хлопьевидного осадка. Образование хлопьев происходит за счет того, что антитела имеют два активных центра, а антигены поливалентны, т.е. имеют несколько антигенных детерминант. РА применяют для идентификации возбудителя, выделенного из материала больного, а также для обнаружения в сыворотке крови больного антител к возбудителю (например, реакции Райта и Хеддлсона при бруцеллезе, реакция Видаля при брюшном тифе и паратифах).
1 Неадсорбированная агглютинирующая сыворотка может агглютинировать родственные бактерии, имеющие общие (перекрестно реагирующие) антигены. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.
Для определения в сыворотке крови больного антител к возбудителю используют развернутую РА. При ее постановке в пробирках разводят сыворотку крови больного и добавляют в пробирки равное количество взвеси диагностикума (взвесь убитых микробов). После инкубации определяют наибольшее разведение сыворотки, при котором произошла агглютинация, т.е. образовался осадок (титр сыворотки). При этом реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) является разновидностью РА. Этот метод обладает высокой чувствительностью. С помощью РНГА можно решить две задачи: определить антитела в сыворотке крови больного, к которой добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум, представляющий собой эритроциты, на которых адсорбированы известные антигены; определить наличие антигенов в исследуемом материале. В этом случае реакцию иногда называют реакцией обратной непрямой гемагглютинацией (РОНГА). При постановке к исследуемому материалу добавляют антительный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности антителами). Эритроциты в этой реакции выполняют роль носителей и пассивно вовлекаются в образование иммунных агрегатов. При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.
Реакция коагглютинации используется для определения клеток возбудителя (антигенов) с помощью антител, адсорбированных на Staphylococcus aureus, содержащем белок А. Белок А обладает сродством к Fc-фрагменту иммуноглобулинов. Благодаря этому антитела связываются с стафилококком опосредованно через Fc- фрагмент, а Fab-фрагменты ориентированы наружу и способны взаимодействовать с соответствующими микробами, выделенными от больных. При этом образуются хлопья.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется при диагностике вирусных инфекций, причем только инфекций, вызываемых гемагглютинирующими вирусами. Эти вирусы содержат на своей поверхности белок - гемагглютинин, который ответствен за реакцией гемагглютинации (РГА) при добавлении к вирусам эритроцитов. РТГА заключается в блокировании антителами вирусных антигенов, в результате чего вирусы теряют способность агглютинировать эритроциты.
Реакция Кумбса - РА для определения неполных антител. При некоторых инфекционных заболеваниях, например при бруцеллезе, в сыворотке крови больного циркулируют неполные антитела к возбудителю. Неполные антитела называют блокирующими, так как они имеют один антигенсвязывающий участок, а не два, как полноценные антитела. Поэтому при добавлении антигенного диагностикума неполные антитела связываются с антигенами, но не склеивают их. Для проявления реакции добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела к иммуноглобулинам человека), которая приведет к агглютинации иммунных комплексов (антигенный диагностикум + неполные антитела), образовавшихся в первой стадии реакции.
Непрямую реакцию Кумбса применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают неполные одновалентные антирезусные антитела. Они специфически взаимодействуют с резусположительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Поэтому в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку, что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных, обусловленную резус-конфликтом.
РА для определения групп крови основана на агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки к антигенам групп крови А(II), B(III). Контролем являются сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка AB(IV) группы крови, и антигены эритроцитов групп А(П) и B(III). В качестве отрицательного контроля применяют эритроциты группы 0(I), поскольку они не имеют антигенов.
Для определения резус-фактора используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток.
Реакция преципитации
РП - это иммунная реакция взаимодействия антител с антигенами в присутствии электролитов, причем антиген находится в растворимом состоянии. При преципитации происходит осаждение растворимых антигенов антителами, что проявляется помутнением в виде полос преципитации. Образование видимого преципитата наблюдается при смешивании обоих реагентов в эквивалентных соотношениях. Избыток одного из них снижает количество осаждающихся иммунных комплексов. Существуют различные способы постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации ставится в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый антиген. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета. Реакция кольцепреципитации, с помощью которой определяют наличие антигенов в органах и тканях, экстракты которых кипятят и фильтруют, называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи для определения термостабильного сибиреязвенного антигена).
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Эта реакция проводится в агаровом геле. В слое геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки и заполняют их антигеном и иммунной сывороткой соответственно. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в геле и становятся видимыми как линии преци-
питации. Эту реакцию можно использовать для определения неизвестных антигенов или антител, а также для проверки сходства между различными антигенами: если антигены идентичны, линии преципитации сливаются, если антигены неидентичны, линии преципитации пересекаются, если антигены частично идентичны, формируется шпора.
Реакция радиальной иммунодиффузии. В расплавленный агаровый гель добавляют антитела и наносят гель равномерным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Во время инкубации антигены радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Этот метод используется для определения антигенов или антител в исследуемом растворе (например для определения концентрации иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови).
Иммуноэлектрофорез. Предварительно электрофоретически разделяют смесь антигенов, затем в канавку, идущую вдоль направления движения белков, вносят преципитирующую антисыворотку. Антигены и антитела диффундируют в гель навстречу друг другу; взаимодействуя, они образуют дугообразные линии преципитации.
Реакция флоккуляции (по Рамону) - разновидность реакции преципитации, которая используется для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина. Реакцию проводят в пробирках. В пробирке, где анатоксин и антитоксин находятся в эквивалентном соотношении, наблюдается помутнение.
Дата добавления: 2021-04-05; просмотров: 30; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!