Методы клонального микроразмножения
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:
1 Получение растений в результате активации уже существующих меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).
2 Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo:
а) индукция органогенеза:
а1)образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;
а2) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани;
б) индукция соматического эмбриогенеза.
Микроклональное размножение и оздоровление растений
Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта, его размера и строения. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, которые заканчиваются образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрого транспорта вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного проникновения через плазмодесмы.
В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.
|
|
|
- Хранение и криосохранение изолированных клеток, тканей и органов.
Методы сохранения генофонда - цель исследователей состоит в увеличении интервала между пересадками.
Существует разные подходы к сохранению клеточных культур растений:
– Криосохранение – замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре –196 oC.
– замедление роста. Для замедления роста большинства культур необходимы факторы, ограничивающие рост. Можно использовать следующие методы:
1 Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).
2 Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.
Чаще всего снижение в нем содержания кислорода (гипоксия), например, выращивание в атмосфере, состоящей из смеси азота (90%) и кислорода (10%). Кроме того, задержку роста можно вызвать, снижая атмосферное давление до 0,014 мм ртутного столба или комбинируя пониженное давление и гипоксию.
3 Изменение светового режима.
4 Охлаждение до температуры прекращения активного роста с использованием в том числе обычных холодильников. Это обычно низкие положительные температуры, для разных культур варьирующие от + 2 до + 10 0С. Период без пересадок можно удлинить до 6-24 месяцев. Данный метод является основным способом получения минимального роста в культуре тканей, используемым для поддержания коллекции из 500 образцов вегетативно размножаемых растений во Всероссийском институте растениеводства им. Н.И.Вавилова (ВИР, Россия, г. Санкт-Петербург) и коллекции клеточных культур (более 2 000 клеточных линий) в Институте клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины (Украина, г. Киев).
|
|
|
5. Применение ретардантов* (соединений, способных замедлять рост): гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (ХХХ – для растительных клеток), абсцизовую кислоту (АБК), из осмотических – маннит в концентрации 3–6%, сорбит, активированный уголь.
* Биологически активные вещества, способные задерживать процесс роста клетки растяжением, объединены под общим названием ретарданты (английское to retard — задерживаю). Эти соединения имеют различную химическую структуру, но обладают одинаковой биологической активностью, выражающейся в задержке деления и растяжения клеток в субапикальной меристеме. Однако полностью рост не останавливается, верхушечная меристема продолжает функционировать. В результате формируются укороченные и утолщенные стебли, перераспределяются пластические вещества между стеблем и репродуктивными органами, более интенсивно формируются структурные элементы, слагающие урожай.
|
|
|
6. Замена СaCl2 на Ca(NO3)2 в питательных средах.
7. Культивирование при оптимальных условиях роста, с периодичностью пассирования материала каждые 3–5–9–12 месяцев, в зависимости от культуры и конкретного клона.
8. Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.
Многие из перечисленных методов минимизации роста растений в культуре тканей применяются очень редко. Они находятся на стадии экспериментальных разработок протоколов, поскольку не изучено их влияние на стабильность генотипов растений. Публикации по данному вопросу немногочисленны.
Обычное время хранения культур с ограниченным ростом составляет около года. Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибели культуры. Таким образом, если полностью отказаться от пересаживания культуры, необходимо использовать такой способ хранения, при котором происходит полная остановка метаболизма.
|
|
|
2.2 Методы получения новых форм и сортов растений
- Клеточная селекция с использованием каллусной ткани
Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований.
Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.
Получение стабильно устойчивых каллусных линий — процесс длительный. Как правило, он включает следующие этапы:
1) Селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов.
2) Этот каллус в дальнейшем используется для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах.
3) На протяжении последующих 4—6 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов, так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми.
4) Затем культуру каллуса переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа.
5) И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты.
*Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов—возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать.Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам.
Достигнуты положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCI или Na2S04. Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз — триптофана, в 5 раз — лизина путем добавления в питательную среду токсичных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили.
Доказано, что проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2—4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.
- Соматическая гибридизация
Слияние протопластов – своеобразный метод гибридизации, так называемая парасексуальная, или соматическая гибридизация. В отличие от обычной гибридизации, где сливаются половые клетки (гаметы), в качестве родительских при парасексуальной гибридизации используются диплоидные клетки растений. Внеядерные генетические детерминанты (цитоплазматическая наследственность) у большинства высших растений наследуются в половом процессе строго одноядерно и матерински.
Возможности соматической гибридизации:
– скрещивание филогенетически отдаленных видов растений (организмов), которые невозможно скрестить обычным половым путем;
– получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого;
– слияние трех и более клеток;
– получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей;
– перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение;
– получение растений, гетерозиготных по внеядерным генам и др.
Парасексуальная гибридизация важна для анализа как ядерных генов, так и внеядерных геномов. Цитоплазматический геном кодирует ряд признаков – скорость фотосинтеза, устойчивость к патогенам, абиотическим факторам и т. д. Наличие косегрегация генов (признаки, контролирующие внеядерный геном, сегрегируют совместно) свидетельствует о физическом сцеплении генов.
Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются.
- Сомаклональная изменчивость
Обычно при регенерации растений в культуре тканей ожидают, что они генетически идентичны источнику. Это ожидание основывалось на том факте, что процесс полностью зависит от митоза, который по идее является консервативным при умножении клеток. Однако данная догма не совсем реальна.
В 1967 году были отмечены среди регенерантов растения, по габитусу (внешнему виду) отличающиеся от исходного, они получили название «сомаклоны».
Сомаклональная изменчивость определяется как генетически переносимая изменчивость, которую можно с частотой 10-3 наблюдать у растений, регенерированных in vitro из эксплантов, клеток или каллусов.
Клетки в культуре in vitro отличаются по морфологии, по биохимическим свойствам, по физиологическому состоянию и генетически. Разнообразие (вариабельность) среди клеточных линий или растений-регенерантов называют сомаклональной вариабельностью.
Происхождение сомаклональной изменчивости. Существует много механизмов, которые объясняют происхождение СИ. Они в основном относятся к двум моделям: 1) предполагает, что СИ уже существует в соматических клетках Э, 2) что СИ образуется в результате культивирования.
Имеется несколько факторов, влияющих на появление изменчивости в растениях-регенерантах: изменения в первичных эксплантах до помещения их в культуру, природа первичного экспланта (тип экспланта: лист, междоузлие, сегмент побега, плоидность экспланта, его генотип), гетерогенность первичной клеточной популяции, продолжительность культивирования культуры тканей, влияние БАВ (цитокининов, гиббереллинов, ауксинов, антибиотиков и др. в-в) при росте каллуса или во время нового образования органов, мутагенная обработка или включение в среду токсических веществ: гербицидов, солей, токсинов, иногда обработка пониженными температурами.
Полиморфизм культивируемых клеток можно объяснить видовыми и возрастными особенностями, уровнем плоидности, влиянием состава питательной среды и условий культивирования, отсутствием коррелятивных связей. Последний фактор, ведущий к нарушению жесткой регуляции, существовавшей в целом растении, видимо, является основной причиной спонтанной изменчивости клеток in vitro .
Любой фрагмент растения представляет собой мозаику различных тканей, и в зависимости от того, какая ткань даст начало каллусу, возникшие даже из одинаковых эксплантов каллусы будут гетерогенными и отличающимися друг от друга. Одинаковых, в полном смысле, эксплантов в природе быть не может, следовательно, неоднородность исходного материала (видовая, возрастная, физиологическая) предопределяет разнокачественность клеток в культуре.
Физиологическая гетерогенность состоит в том, что клетки в популяции находятся в разном физиологическом состоянии, т. е. делятся, растут, стареют, погибают. Такая культура называется асинхронной. Заставить популяцию клеток высших растений проходить фазы клеточного цикла одновременно, т. е. синхронизировать их, почти невозможно. Потому что та часть клеток, которая способна в данный момент к делению, составляет 2–4%. Неблагоприятные условия (низкая температура, исключение важных компонентов питания), задерживающие деление, в какой-то степени способствуют накоплению числа клеток, готовых к делению. Более эффективны некоторые химические вещества, блокирующие определенные стадии подготовки к делению. В лучших случаях синхронизация может быть достигнута у 10–30% клеток, но при последующих делениях популяция опять быстро утрачивает синхронность.
Следует подчеркнуть, что физиологическая вариабельность клеток в суспензионной культуре меньше по сравнению с культурой каллусной ткани на агаре, что связано с более однородными условиями питания, аэрации и удаления токсических метаболитов из клеточного окружения в жидкой перемешиваемой среде.
Возможные механизмы изменчивости. Генетическая природа и механизм возникновения СИ пока слабо изучены, несмотря на интенсивность исследований.
Часто изменения связаны с количественным и структурным состоянием хромосом:
1) Кариотипические изменения . Даже клетки одной и той же ткани, выращиваемые в одном сосуде, могут значительно различаться между собой по хромосомным наборам (диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные).
Причины генетической изменчивости многообразны: 1) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения, т. е. отсутствие организменного контроля; 2) действие компонентов среды; 3) влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде; 4) гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа.
Обычно после 6 месяцев культивирования процент кариотипически измененных клеток повышается. Однако у некоторых растений (картофель, сорго) несмотря на ненормальность в строении листьев и всего габитуса растений, кариотип остался неизменным.
2) Скрытые изменения, связанные с хромосомными перестройками.
У многих растений отмечали делеции, инверсии, дупликации, кольцевые хромосомы, хромосомные мосты.
Такие хромосомные перестройки могут приводить к потере генетического материала, что сказывается на изменении фенотипа. Скрытые изменения могут приводить не только к потере генов и их функций, но также к экспрессии молчащих генов. Например, перестройка может уничтожить или выключить доминантный аллель, позволяя рецессивному гену проявиться в фенотипе. Такие крупные цитологические нарушения сопряжены с уменьшением фертильности растений-регенерантов.
3) Причинами изменений могут быть ядерные фрагментации и миграции ядерного материала; эндоредупликация, встречающаяся на протяжении инициации каллуса; нарушение митотических процессов.
4) Транспозоны .
Larkin (1985) предложил несколько механизмов, при помощи которых генная экспрессия наследуемо изменяется мобильными элементами: вставочный разрыв (элементы разрывают целостность структурных генов); регуляция гена мобильными элементами (элемент действует как промотор гена); активация мобильными элементами молчащих генов; перенесение уникальной последовательности генов в позиции с другой регуляцией; согласованный контроль генов (возможно имеется один автономный элемент, который регулирует экспрессию многочисленных неавтономных элементов и генов, на которых они размещаются); мобильный элемент как интрон (вырезанные элементы перемещаются с геном и действуют как интрон).
5) Амплификация генов. Специфические гены могут сами по себе увеличиваться (амплифицироваться) во время дифференциации или в ответ на средовые воздействия, т.е. число копий определенного гена на гаплоидный геном возрастает. Отмечали, например, у льна.
6) Скрытая элиминация вирусов. У растений имеются вирусы, которые не вызывают очевидных симптомов заболевания, но изменяют генотип растения.
7) Измененная экспрессия мультигенных блоков.
Условия культивирования вызывают хромосомные перестройки, и могут изменять регуляцию экспрессии блока генов таким образом, что ген, который прежде экспрессировался, может быть репрессирован, а прежде молчащий ген может начать экспрессироваться. Способность генерировать такие изменения в культуре может иметь важное значение для селекции. Так как некоторые ценные белки кодируются мультигенными блоками (например, глиадины, зеины, глютеины, амилазы).
8) Цитоплазматические изменения (наряду с ядерными). Известно, что изменения хлоропластных и митохондриальных генов происходит с высокой частотой.
Применение СИ в селекции
Одна из главных потенциальных возможностей СИ – это создание дополнительной генетической вариабельности у агрономически полезных сортов без использования гибридизации.
Сомаклональные варианты имеют, несомненно, практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам. Для большей эффективности скрининга растений необходимо использование селективных агентов. Сомаклональные мутанты могут быть улучшены в процессе культивирования in vitro по таким признакам, как устойчивость к болезням, гербицидам, неблагоприятным условиям внешней среды.
Например, были получены сомаклоны картофеля сорта Зарево, который характеризуется высокой урожайностью, устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях крахмала и протеина. Причем наследование важных признаков при размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых испытаний (В.В. Сидоров и др., 1984, 1985). Получены сорта у сахарного тростника, томата, табака, у ряда лекарственных и декоративных культур. Примером тому может служить новый сорт пеларгонии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру.
Таким образом, полученные положительные результаты свидетельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам.
- Применение методов генной инженерии. (См. след. вопросы)
Дата добавления: 2021-01-20; просмотров: 76; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!