Основываясь на предложенных данных рассчитайте активность каталазы по предложенной формуле, заполните таблицу, сделайте вывод о влиянии внешних факторов на активность каталазы.
Лабораторная работа «Определение активности каталазы растений»
Вопросы для подготовки к лабораторной работе
1. Макромолекулярная структура каталазы. Биороль этого фермента в клетках растительного происхождения.
2. Структура активного центра сложных металлокомплексных ферментов на примере каталазы.
3. Приведите схему каталитического действия каталазы.
4. Специфичность действия каталазы, теории, объясняющие специфичность действия ферментов.
5. Принцип метода перманганатометрии. Уравнение ОВР KMnO4 + H2O2 в кислой среде. Значение фактора эквивалентности для перманганата калия в кислой среде и для пероксида водорода.
6. Какие ещё методы кроме перманганатометрии можно использовать для количественного определения пероксида водорода, в чем их суть.
Каталаза относится к классу ферментов оксидоредуктаз, катализирует реакцию разложения пероксида водорода на воду и молекулярный кислород по уравнению
Каталаза играет важную роль в жизнедеятельности организмов, она удаляет из клеток избыток пероксида водорода, образующийся в окислительно-восстановительных процессах.
Количественное определение активности каталазы основано на установлении содержания пероксида водорода путем титрования его перманганатом калия в кислой среде.
| Реактивы и материалы: | Пероксид водорода, 1 %-й раствор. Серная кислота, 10 %-й раствор. Перманганат калия, 0,1 н. раствор. Соляная кислота, 0,1 н. раствор. Гидроксид калия, 0,1 н. раствор. Оксид алюминия, кристаллический. |
| Объект исследования: | Пророщенные семена фасоли. |
Порядок выполнения работы
|
|
|
Пророщенные семена фасоли взвешивают, затем растирают в ступке, постепенно прибавляя 2–3 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Смесь оставляют стоять на протяжении 30–40 мин., после чего жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр. В коническую колбу на 200 мл отбирают пипеткой 10 мл 1 %-го раствора Н2О2 и добавляют пипеткой 15 мл вытяжки фермента. Через 30 мин. действие фермента останавливают прибавлением 3 мл 10 %-го раствора H2SO4. Смесь оттитровывают 0,1 н. раствором перманганата калия до появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 1 мин. Отмечают количество перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося пероксида водорода.
Одновременно исследуют контрольную пробу с инактивированным ферментом. Для этого нагревают вытяжку (15 мл) в кипящей водяной бане на протяжении 5 мин. После охлаждения к этому раствору добавляют 10 мл 1 %-го раствора пероксида водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин., после чего добавляют 3 мл 10 % серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование пероксида водорода.
|
|
|
Активность каталазы (К) выражают в микромоль пероксида водорода, разложившегося под действием фермента за 1 мин. В расчете на 1 г исследуемого материала. Активность каталазы определяют по формуле
,
где К – активность каталазы (каталазное число); а – объем 0,1 н. раствора KmnO4, израсходованного на титрование контрольного раствора, мл; b – объем 0,1 н. раствора KmnO4, израсходованного на титрование опытной пробы, мл; V – общий объем экстракта, мл; 50 – коэффициент перерасчета на мкмоль H2O2; 15 – объем ферментного раствора, мл; 30 – время ферментативной реакции, мин.; Р – навеска исследуемого материала, взятого для анализа, г; F – поправка к титру перманганата калия.
Термолабильность каталазы
В колбу наливают 6 мл воды, 3 мл вытяжки фермента, кипятят 2–3 мин. После охлаждения в пробу приливают 2 мл 1 %-го раствора перекиси водорода, через 30 мин. Добавляют 3 мл 10 %-го раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия.
|
|
|
Влияние рН среды на активность каталазы
Максимальную каталитическую активность ферменты проявляют при определенных условиях, в том числе при определенных значениях рН среды. Любой фермент проявляет наибольшую активность в довольно узких пределах рН, максимальное значение является оптимумом рН. Активность уменьшается, если значение рН меняется в любую сторону от оптимального. Ферментативные реакции чувствительны к изменению рН, поскольку ферменты содержат большое количество ионогенных групп. Максимальную активность он может проявлять при определенном соотношении групп, находящихся в ионизированном или неионизированном состоянии. Кроме того, величина рН может влиять на активность ферментов, дестабилизируя их структуру, например, изменять прочность связи апофермента с небелковым компонентом.
Порядок выполнения работы
В три колбы наливают по 2 мл вытяжки фермента, добавляют по 3 мл воды. В первую колбу добавляют 1 мл воды, во вторую – 1 мл 0,1 н. раствора HСl, в третью – 1 мл 0,1 н. раствора КОН. Во все колбы добавляют по 1 мл 1 %-го раствора перекиси водорода и через 30 мин. Добавляют 2 мл 10 %-го раствора серной кислоты. Содержимое каждой колбы титруют раствором перманганата калия и рассчитывают активность фермента.
|
|
|
Адсорбция каталазы
Порядок выполнения работы
В пробирку наливают 3–5 мл вытяжки фермента, добавляют небольшое количество оксида алюминия и пробу встряхивают на протяжении 3-5 мин. Содержимое пробирки отфильтровывают. В колбу наливают 2 мл фильтрата, добавляют 8 мл воды, 2 мл 1 %-го раствора перекиси водорода. Через 30 мин. К пробе приливают 3 мл 10 %-го раствора серной кислоты, пробу оттитровывают 0,1 н. раствором перманганата калия. По результатам титрования делают выводы о степени адсорбции фермента.
|
| Контроль- ная проба | Опытная проба | Термола-бильность | рН среды | Адсорб-ция фермента | ||
| 2 | 7 | 12 | |||||
| V KmnO4, израсходо-ванный на титрование | |||||||
| К | |||||||
После проведенных процедур титрования получены следующие объемы израсходованного перманганата калия:
1. Контрольная проба – 59 мл;
2. Опытная проба – 1,3 мл;
3. Термолабильность – 2,5 мл;
4. pH 2.0 – 51 мл;
5. pH 7.0 – 0,9 мл;
6. pH 12.0 – 12 мл;
7. Адсорбция фермента – 33 мл.
Основываясь на предложенных данных рассчитайте активность каталазы по предложенной формуле, заполните таблицу, сделайте вывод о влиянии внешних факторов на активность каталазы.
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 161; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!