Определение подвижности микроорганизмов
Задание № 1 для самостоятельной подготовки студентов 111-112 групп по дисциплине «МИкробиология и Основы иммунологии» ( Направление 36.03.01 )
1. Повторить темы: «Простые и сложные способы окрашивания. Окраска по Граму»
2. Изучить самостоятельно тему: « Споры и капсулы. Окраска спор и капсул. Исследование бактерий на подвижность». Подготовиться к тестированному контролю.
Литература:
Учебник Маннапова Р.Т. Микробиология. Практикум (Учебник .-М.: Изд-во Прогресс.-2019.- 440 с. ) Стр. 22-31. Тесты : 298-307.
Электронная верси учебника www . prospekt . org
Задание 1. Повторить Простые и сложные способы окрвшивания. Окраску по Граму.
Изучить самостоятельно: Споры и капсулы. Окраска спор и капсул». Подготовится к тестированному контролю .
Тема: Приготовление, фиксация и окраска препаратов. Микробиологические краски. Простые и сложные методы окрашивания микроорганизмов (по Граму)
2.1 Цель занятия. Овладеть методикой приготовления мазка-препарата для микроскопии из микробной взвеси. Приготовить, окрасить (фуксином или метиленовой синькой) и зарисовать препараты из микробных культур. Отработать методику простого и сложных методов окраски приготовленных препаратов.
2.2 Материалы и оборудование. Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты стрептококка и диплококка, таблица - морфология микробов.
|
|
|
Теоретический материал
2.3.1 Приготовление бактерийных препаратов для микроскопирования. Для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале и изучения их тинкториально-морфологических свойств, необходимо приготовить препараты, окрасить их и изучить под микроскопом.
Препараты для микроскопирования готовят на предметных стеклах. Материалом служат взвеси бактериальных культур, выросших на питательных средах, молоко, мясо. Из таких материалов готовят препараты-мазки. Из тканей различных органов – препараты-отпечатки.
Предметные стекла, используемые при этом, должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Стекла хранят в банках с притертыми пробками в смеси из равных частей этилового спирта и эфира или в 96,6% спирте ректификате. Возможно, обезжиривание предметных стекол кусочком мыла.
Нанесение микробной взвеси на стекло производят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Бактериологические петли готовят из платиновых или нихромовых нитей в виде замкнутой петли, диаметром 2-3 мм.
|
|
|
Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:
1.Обезжиривание предметного стекла.
2.Приготовление мазка.
3.Высушивание препарата.
4.Фиксация мазка.
5.Окраска мазка.
В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.
Обезжиривание предметного стекла. Стекла, не бывшие в употреблении, сначала моют в воде, затем выдерживают в смеси спирта-эфира, фламбируют над пламенем горелки – это и есть обезжиривание. Новые стекла можно готовить путем кипячения 10 мин. в 1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде с добавлением 0,5% соляной кислоты с целью нейтрализации и окончательного споласкивания в дистиллированной воде.
Приготовление мазка. Для приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю прокаливают до красна (стерилизуют фламбированием), внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего из пробирки с культурой вынимают пробку захватывая ее мизинцем и ладонью правой руки (рисунок 2.1).
|
|
|
Пробирку с культурой следует держать левой рукой, пробкой к себе. Вынув пробку, края пробирки обжигают и вносят в нее бактериологическую петлю. Прежде чем захватить небольшое количество культуры, петлю охлаждают, касаясь стенок пробирки. Петлю с культурой осторожно вынимают, еще раз обжигают края пробирки, а культуру вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого овала или круга (1,5-2 см в диаметре). По окончании приготовления мазка петлю вновь прокаливают.
Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло петлей 1-2 раза наносят исследуемый материал и равномерно распределяют.
Приготовленный препарат высушивают на воздухе, просохший мазок фиксируют.
Пастеровскими пипетками делают мазки из жидкостей и бульонных культур. Пипетка должна быть стерильной. Над пламенем горелки отламывают запаянный конец и набирают материал. После нанесения капли культуры на предметное стекло и ее распределения пипетку отпускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок высушивают при комнатной температуре.
|
|
|
Фиксация мазка. Фиксацию мазка проводят физическим и химическим способами.
Физический способ фиксации – над пламенем горелки. Для этого предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом и проводят 3-4 раза над пламенем горелки, каждый раз, прикладывая стекло к коже руки. Ощущение жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. При этом бактерии погибают, плотно прикрепляясь к стеклу. Этот способ нельзя применять при исследовании клетки.
Химический способ используют для фиксации мазков из крови и мазков-отпечатков, так как при действии высоких температур разрушаются клеточные элементы. Для этого препараты погружают в фиксирующую жидкость:
Рисунок 2.1 Схема приготовления препарата-мазка
в метиловый спирт - на 5 минут, в этиловый спирт - на 10минут, ацетон - 5 минут, смесь Никифорова (равный объем спирта и эфира) - на 15 минут.
Цель фиксации:
1) Закрепить бактерий на стекле.
2) Умертвить микробные клетки, обезопасив себе работу.
3) Коагулировать белок клетки, после чего она лучше воспринимает краситель.
2.3.2 Окраска мазка. В микробиологической практике для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:
-синие – метиловый синий, водный синий, опаловый синий;
-красные – фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;
-фиолетовые – метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет;
-зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый;
-желто-коричневые – хризоилин, везувин.
При простом методе окраски применяют только один краситель. Раствором краски покрывают охлажденный фиксированный мазок, выдерживают 2-5 минут, краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией. Этот способ окраски позволяет обнаружить в материале микроорганизмы и дать некоторые представления об их морфологии.
При сложных методах окрашивания применяют несколько растворов красителей и реактивов. Они основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток. Эти методы позволяют помимо морфологии бактерий, определить их тинкториальные особенности (различное окрашивание при использовании специальных методов) и наличие или отсутствие структурных элементов клетки (капсула, спора), что имеет важное дифференциально-диагностическое значение. Химический состав и строение клеточной стенки микробов различны, поэтому они окрашиваются одними и теми же красителями по-разному и неодинаково отдают их при последующем обесцвечивании этиловым спиртом, кислотами и другими реактивами. Части микробной клетки избирательно реагируют на красящие растворы. На этом свойстве основаны сложные (дифференциальные) методы окрашивания микробов. Для сложного окрашивания используют несколько красителей. В лабораторной практике применяют методы Грама, Циля–Нильсена, Козловского и др.
2.3.3 Окраска по Граму. Метод Грама (модификация по Синеву). Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр–).
На фиксированный мазок помещают:
1.Кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной 1%-ым спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2-3 капли воды и окрашивают 2-3 минуты. Бумагу снимают, мазок не промывают.
2.Наносят раствор Люголя на 2 минуты, смывают водой.
3.Обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20-30 секунд и тщательно смывают мазок водой.
4. Докрашивают мазок фуксином в течение 2-3 мин и промывают водой.
5. Высушивают на воздухе и микроскопируют.
Микроскопическая картина: грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в розовый.
Окраска микроорганизмов по этому методу зависит от химического состава клеточной стенки (наличие муреина и частично липида), цитоплазмы и pH среды.
2.3.4 Окраска по Цилю-Нильсену. На фиксированный мазок наносят:
небольшой кусок фильтровальной бумаги, на него наносят раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем горелки до появления паров и оставляют на «мостике» 5-7 минут. Затем краску с бумагой убирают (не промывая). Наносят 3-5% раствор серной кислоты, окрашивают 5-7 минут, хорошо промывают водой. Затем добавляют раствор метиленовой сини (по Леффлеру), окрашивают 4-5 минут. Препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина: кислото-спиртоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), некислотоустойчивые – в синий (окрасившись первоначально фуксином в красный цвет, легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают дополнительную окраску метиленовой сини).
Задание
Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.
Задание 2. Окрасить препараты простым методом (фуксином или метиленовой синькой) и по Граму, зарисовать.
Вопросы для самоконтроля знаний
1.Красители, применяемые в микробиологии.
2.Способы и цели фиксации.
3.Порядок приготовления препарата для микроскопии и простой метод окраски.
4.Методика приготовления мазка.
5.Способы обработки предметных и покровных стекол.
6.Какие существуют методы фиксации?
7.Чем обуславливается различное окрашивание бактерий по Граму?
9. Каково действие спирта при окрашивании по Граму?
Тема: Методы окрашивания спор и капсул. Исследование бактерий
На подвижность
3.1 Цель занятия. Овладеть методами окрашивания препаратов на капсулы и споры. Приготовить, окрасить и зарисовать препараты из микробных культур на споры. Освоить методики определения подвижности микроорганизмов.
3.2 Материалы и оборудование. Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты на капсулы, таблицы и рисунки спор и капсул микробов.
Теоретический материал
3.3.1 Окраска спор. Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву.
Окраска спор по Златогорову. На фиксированный мазок наносят:
1. Карболовый фуксин, окрашивают 5-10 мин.
2. 2% раствор серной кислоты, выдерживают 2-3 сек.
3. Раствор метиленовой сини, окрашивают 3-5 мин.
Микроскопическая картина: споры красного цвета, вегетативные формы – синие.
3.3.2 Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой.
Капсула – слизистый слой оболочки, муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, который синтезируется в цитоплазме и секретируется на поверхности клеточной стенки (является производным наружного слоя оболочки).
Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Размеры их чаще превышают тело микробной клетки. Химический состав капсул неоднородный: одни из них состоят из комплекса белков, другие – из полисахаридов. Капсула и остальная часть клетки окрашиваются неодинаково: первая как бы выполняет роль защиты и часто встречается у патогенных микроорганизмов.
Существует несколько методов окрашивания капсул
Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:
1. Мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется.
2.Фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метахромотические краски, при использовании которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула - в другой;
3.Промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Окраска капсул по Михину. На фиксированный мазок наносят:
1.Метиленовый голубой Леффлера (лучше старый раствор), окрашивают 2-3 мин, при подогревании.
2.Смывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: тела микробных клеток темно-синего цвета, капсулы – светло-розового.
Окраска капсул по Ольту. На фиксированный мазок наносят:
1.Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина, окрашивают 5-7 минут.
2.Быстро промыть водой и высушивают.
Микроскопическая картина: тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула – в желто-оранжевый.
Определение подвижности микроорганизмов
У подвижных видов органами передвижения являются жгутики, которые осуществляют вращательные движения. Расположение их на теле микробной клетки различное. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии.
В зависимости от расположения и количества жгутиков микроорганизмы подразделяют на:
а) монотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик. Это самые подвижные бактерии, движения активные, поступательные (псеудомонас);
б) лофотрихи - микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков, движения активные, поступательные (листерии);
в) амфитрихи - микроорганизмы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки, передвигаются беспорядочно;
г) перитрихи - микроорганизмы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки, передвигаются беспорядочно (кишечная палочка).
Типы расположения жгутиков у бактерий
Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться. Исследование проводят путем приготовления висячей или раздавленной капли.
Метод «висячая капля». Висячую каплю готовят на предметном стекле с углублением (луночкой). Край луночки смазывают тонким слоем вазелина и наносят на покровное стекло микроорганизмы. Если они выращены в жидкой среде, берут каплю такой культуры, если на плотной, то сначала на покровное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида, а затем культуру микробов. Предметное стекло проворачивают на 180° и аккуратно опускают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре углубления, после чего его возвращают в прежнее положение. В таком препарате капля подвешена с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой влажной камере Это позволяет наблюдать за движением микробов в течение длительного времени. Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают), что увеличивает контрастность неокрашенных форм.
Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».
Задание
Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.
Задание 2. Окрасить препараты на споры по методу Златогорова, зарисовать.
Задание 3. Определить подвижность предложенных культур микроорганизмов методами «висячая» и «раздавленная капля»
Вопросы для самоконтроля знаний
1. Какова особенность окраски препаратов на споры?
2. Какие применяют методы окрашивания капсул?
3. Как исследуют микроорганизмы на подвижность?
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 2187; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!