Современное состояние биофизики.
В тесной связи с проблемами молекулярной биологии шло развитие биофизики. Интерес к этой области биологии стимулировался, с одной стороны, необходимостью всестороннего изучения действия на организм различного рода излучений, с другой – потребностью исследования физических и физико‑химических основ жизненных явлений, протекающих на молекулярном уровне.
Получение точных сведений о молекулярных структурах и совершающихся в них процессах стало возможным в результате применения новых тонких физико‑химических методов. На основе достижений электрохимии удалось усовершенствовать метод измерения биоэлектрических потенциалов, применив ионно‑избирательные электроды (Г. Эйзенман, Б.П. Никольский, Кхури, 50‑60‑е годы). Все шире входит в практику инфракрасная спектроскопия (с использованием лазерных устройств), позволяющая исследовать конформационные изменения белков (И. Плотников, 1940). Ценные сведения дает также метод электронного парамагнитного резонанса (Е.К. Завойский, 1944) и биохемолюминесцентный метод (Б.Н. Тарусов и др., 1960), которые позволяют, в частности, судить о транспорте электронов при окислительных процессах.
К 50‑м годам биофизика завоевывает уже прочное положение. Возникает потребность в подготовке квалифицированных специалистов. Если в 1911 г. в Европе только в университете г. Печ, в Венгрии, была кафедра биофизики, то к 1973 г. такие кафедры существуют почти во всех крупных университетах.
|
|
|
В 1960 г. было организовано Международное общество биофизиков. В августе 1961 г. состоялся первый Международный биофизический конгресс в Стокгольме. Второй конгресс был проведен в 1965 г. в Париже, третий – в 1969 г. в Бостоне, четвертый – в 1972 г. в Москве.
В биофизике сохраняется четкое разграничение между двумя различными по содержанию направлениями – молекулярной биофизикой и клеточной биофизикой. Это разграничение получает и организационное выражение: создаются раздельные кафедры этих двух направлений биофизики. В Московском университете первая кафедра биофизики была создана в 1953 г. на биолого‑почвенном факультете, несколько позже возникла кафедра биофизики на физическом факультете. По такому же принципу организовывались кафедры во многих других университетах.
Молекулярная биофизика.
В последние годы все больше укреплялась связь молекулярной биофизики с молекулярной биологией, и сейчас бывает иногда трудно определить, где проходит граница раздела между ними. В генеральном наступлении на проблему наследственной информации такая кооперация биофизики с молекулярной биологией неизбежна.
|
|
|
Главным направлением в исследовательской работе является изучение физики нуклеиновых кислот – ДНК и РНК. Применение указанных, выше методов и прежде всего рентгеноструктурного анализа способствовало расшифровке молекулярной структуры нуклеиновых кислот. В настоящее время ведутся интенсивные исследования по изучению поведения этих кислот в растворах. Особое внимание уделяется при этом конформационным переходам «спираль‑клубок», изучаемым по изменениям вязкости, оптическим и электрическим показателям. В связи с изучением механизмов мутагенеза развиваются исследования по изучению действия ионизирующей радиации на поведение нуклеиновых кислот в растворах, а также действия радиации на нуклеиновые кислоты вирусов и фагов. Всестороннему анализу подвергалось влияние ультрафиолетового излучения, некоторые спектральные участки которого, как известно, хорошо поглощаются нуклеиновыми кислотами. Большой удельный вес в такого рода исследованиях занимает обнаружение активных радикалов нуклеиновых кислот и белков методом электронного парамагнитного резонанса. С применением этого метода связано возникновение целого самостоятельного направления.
|
|
|
Проблема кодирования информации ДНК и РНК и ее передачи при синтезе белка давно интересовала молекулярную биофизику, и физики неоднократно высказывали по этому поводу те или иные соображения (Э. Шредингер, Г. Гамов). Расшифровка генетического кода вызвала многочисленные теоретические и экспериментальные исследования по структуре спирали ДНК, механизму скольжения и закручивания ее нитей, по изучению физических сил, участвующих в данных процессах.
Значительную помощь молекулярная биофизика оказывает молекулярной биологии в изучении структуры белковых молекул при помощи рентгеноструктурного анализа, впервые примененного в 1930 г. Дж. Берналом. Именно в результате использования физических методов в сочетании с биохимическими (ферментативные методы) была вскрыта молекулярная конформация и последовательность расположения аминокислот в ряде белков.
Современные электронно‑микроскопические исследования, выявившие наличие в клетках и ее органоидах сложных мембранных систем, стимулировали попытки понять их молекулярное строение (см. главы 10 и 11). Изучается прижизненно химический состав мембран и, в частности, свойства их липидов. Было выяснено, что последние способны к переокислению и неферментативным реакциям цепного окисления (Ю.А. Владимиров и Ф.Ф. Литвин, 1959; Б.Н. Тарусов и др., 1960; И.И. Иванов, 1967), приводящим к нарушению мембранных функций. Для изучения состава мембран стали пользоваться также методами математического моделирования (В. Ц. Пресман, 1964–1968; М.М. Шемякин 1967; Ю.А. Овчинников, 1972).
|
|
|
Клеточная биофизика.
Знаменательным событием в истории биофизики явилось формирование в 50‑х годах четких представлений о термодинамике биологических процессов, в результате чего окончательно отпали предположения о возможности самостоятельного образования энергии в живых клетках вопреки второму закону термодинамики. Понимание действия этого закона в биологических системах связано с введением бельгийским ученым И. Пригожиным (1945)[187] в биологическую термодинамику понятия открытых систем, обменивающихся с внешней средой энергией и материей. Пригожин показал, что положительная энтропия образуется в живых клетках при рабочих процессах соответственно второму закону термодинамики. Введенные им уравнения определили условия, при которых возникает так называемое стационарное состояние (ранее его именовали также динамическим равновесием), при котором количество свободной энергии (негэнтропии), поступающей в клетки с пищей, компенсирует ее расход, а положительная энтропия выводится. Это открытие подкрепило общебиологическую идею о неразрывной связи внешней и внутренней среды клеток. Оно положило начало реальному изучению термодинамики живых систем, в том числе методом моделирования (А. Бэртон, 1939; А.Г. Пасынский, 1967).
Согласно основному принципу биотермодинамики, необходимым условием существования жизни оказывается стационарность в развитии ее биохимических процессов, для осуществления которой необходима координация скоростей многочисленных реакций обмена веществ. На основе новой биофизической термодинамики возникло направление, выделяющее внешние и внутренние факторы, которые обеспечивают эту координацию реакций и делают ее устойчивой. За последние два десятилетия выявлена большая роль в поддержании стационарного состояния системы ингибиторов и особенно антиоксидантов (Б.Н. Тарусов и А.И. Журавлев, 1954, 1958). Установлено, что надежность стационарного развития связана с факторами внешней среды (температурой) и физико‑химическими свойствами среды клеток.
Современные принципы биотермодинамики позволили дать физико‑химическое истолкование механизму адаптации. По нашим данным, приспособление к условиям внешней среды может происходить только в том случае, если при их изменении организм способен установить стационарность в развитии биохимических реакций (Б.Н. Тарусов, 1974). Встал вопрос о разработке новых методов, которые позволили бы оценивать стационарное состояние прижизненно и прогнозировать его возможные нарушения. Большую пользу сулит внедрение в биотермодинамику и исследования процессов биологической адаптации кибернетических принципов саморегулирующихся систем. Стало ясно, что для решения вопроса об устойчивости стационарного состояния важен учет так называемых возмущающих факторов, к которым относятся, в частности, неферментативные реакции окисления липидов. В последнее время все более расширяются исследования процессов переокисления в липидных фазах живых клеток и нарастания активных радикальных продуктов, нарушающих регуляторные функции мембран. Источником информации об этих процессах служит как обнаружение активных перекисных радикалов, так и перекисных соединений биолипидов (А. Таппель, 1965; И.И. Иванов, 1965; Е.Б. Бурлакова, 1967 и другие). Для обнаружения радикалов используют биохемолюминесценцию, возникающую в липидах живых клеток при их рекомбинации.
На основе физико‑химических представлений о стабильности стационарного состояния возникли биофизические представления об адаптации растений к изменениям условий внешней среды как нарушении ингибирующих антиокислительных систем (Б.Н. Тарусов, Я.Е. Доскоч, Б.М. Китлаев, А.М. Агавердиев, 1968–1972). Это открыло возможность оценивать такие свойства, как морозоустойчивость и солеустойчивость, а также делать соответствующие прогнозы при селекции сельскохозяйственных растений.
В 50‑х годах было открыто сверхслабое свечение – биохемолюминесценция ряда биологических объектов в видимой и инфракрасной частях спектра (Б.Н. Тарусов, А.И. Журавлев, А.И. Поливода). Это стало возможным в результате разработки методов регистрации сверхслабых световых потоков при помощи фотоэлектронных умножителей (Л.А. Кубецкий, 1934). Являясь результатом биохимических реакций, протекающих в живой клетке, биохемолюминесценция позволяет судить о важных окислительных процессах в цепях переноса электронов между ферментами. Открытие и изучение биохемолюминесценции имеет большое теоретическое и практическое значение. Так, Б.Н. Тарусов и Ю.Б. Кудряшов отмечают большую роль продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот в механизме возникновения патологических состояний, развивающихся под действием ионизирующих излучений, при канцерогенезе и других нарушениях нормальных функций клетки.
В 50‑х годах в связи с бурным развитием ядерной физики из биофизики выделилась радиобиология, исследующая биологическое действие ионизирующих излучений. Получение искусственных радиоактивных изотопов, создание термоядерного оружия, атомных реакторов и развитие других форм практического использования атомной энергии поставило со всей остротой проблему защиты организмов от вредного действия ионизирующей радиации, разработки теоретических основ профилактики и лечения лучевой болезни. Для этого необходимо было в первую очередь выяснить, какие компоненты клетки и звенья обмена веществ наиболее уязвимы.
Объектом изучения биофизики и радиобиологии стало выяснение природы первичных химических реакций, возникающих в живых субстратах под воздействием энергии излучений. Здесь было важно не только понять механизмы этого явления, но и суметь воздействовать на процесс размена физической энергии на химическую, уменьшить его коэффициент «полезного» действия. Работам в этом направлении положили начало исследования школы Н.Н. Семенова (1933) в СССР и Д. Хиншельвуда (1935) в Англии.
Большое место в радиобиологических исследованиях заняло изучение степени радиационной сопротивляемости различных организмов. Было установлено, что повышенная радиорезистентность (например, грызунов пустынь) обусловлена высокой антиокислительной активностью липидов клеточных мембран (М. Чанг и др., 1964; Н.К. Огрызов и др., 1969). Оказалось, что в формировании антиоксидативных свойств этих систем большую роль играют токоферолы, витамин К и тиосоединения (И.И. Иванов и др., 1972). В последние годы большое внимание привлекают к себе также исследования механизмов мутагенеза. С этой целью изучается действие ионизирующих излучений на поведение нуклеиновых кислот и белков in vitro, а также в вирусах и фагах (А. Густафсон, 1945–1950).
Борьба за дальнейшее повышение эффективности химической защиты, поиск более эффективных ингибиторов и принципов ингибирования остаются в этом направлении основными задачами биофизики.
Продвинулось вперед исследование возбужденных состояний биополимеров, определяющих их высокую химическую активность. Наиболее успешно шло научение возбужденных состояний, возникающих на первичной стадии фотобиологических процессов – фотосинтеза и зрения.
Так, сделан солидный вклад в понимание первичной активации молекул пигментных систем растений. Установлено большое значение переброски (миграции) энергии возбужденных состояний без потерь с активированных пигментов на другие субстраты. Большую роль в развитии этих представлений сыграли теоретические работы А.Н. Теренина (1947 и позднее). А.А. Красновский (1949) открыл и исследовал реакцию обратимого фотохимического восстановления хлорофилла и его аналогов. Ныне складывается всеобщее убеждение, что в ближайшем будущем можно будет воспроизвести фотосинтез в искусственных условиях (см. также главу 5).
Биофизики продолжают работать над раскрытием природы мышечного сокращения и механизмов нервного возбуждения и проведения (см. главу 11). Актуальное значение приобрели также исследования механизмов перехода от возбужденного состояния к норме. Возбужденное состояние рассматривают теперь как результат автокаталитической реакции, а торможение – как следствие резкой мобилизации ингибиторной антиокислительной активности в результате молекулярных перегруппировок в таких соединениях, как токоферол (И.И. Иванов, О.Р. Колье, 1966; О.Р. Колье, 1970).
Важнейшей общей проблемой биофизики остается познание качественных физико‑химических особенностей живой материи. Такие свойства, как способность живых биополимеров избирательно связывать калий или поляризовать электрический ток, не удается сохранить даже при их самом осторожном извлечении из организма. Поэтому клеточная биофизика продолжает интенсивно разрабатывать критерии и методы для прижизненного исследования живой материи.
* * *
Несмотря на молодость молекулярной биологии, успехи, достигнутые ею в этой области, поистине ошеломляющи. За сравнительно короткий срок установлена природа гена и основные принципы его организации, воспроизведения и функционирования. Более того, осуществлено не только размножение генов in vitro, но и впервые завершен полный синтез самого гена. Полностью расшифрован генетический код и разрешена важнейшая биологическая проблема специфичности биосинтеза белка. Выявлены и исследованы главные пути и механизмы образования белка в клетке. Полностью определена первичная структура многих транспортных РНК – специфических молекул‑адапторов, осуществляющих перевод языка нуклеиновых матриц на язык аминокислотной последовательности синтезирующегося белка. До конца расшифрована аминокислотная последовательность многих белков и установлена пространственная структура некоторых из них. Это дало возможность выяснять принцип и детали функционирования молекул ферментов. Осуществлен химический синтез одного из ферментов – рибонуклеазы. Установлены основные принципы организации разных субклеточных частиц, многих вирусов и фагов и разгаданы основные пути их биогенеза в клетке. Вскрыты подходы к пониманию путей регуляции активности генов и выяснению регуляторных механизмов жизнедеятельности. Уже простой перечень этих открытий свидетельствует о том, что вторая половина XX в. ознаменовалась огромным прогрессом биологии, который обязан прежде всего углубленному изучению структуры и функций биологически важнейших макромолекул – нуклеиновых кислот и белков.
Достижения молекулярной биологии уже сегодня используются па практике и приносят ощутимые плоды в медицине, сельском хозяйстве и некоторых отраслях промышленности. Несомненно, что отдача этой науки будет возрастать с каждым днем. Однако главным итогом все же следует считать, что под влиянием успехов молекулярной биологии укрепилась уверенность в существовании неограниченных возможностей на пути раскрытия самых сокровенных тайн жизни.
В будущем, по‑видимому, будут открыты новые пути исследования биологической формы движения материи – с молекулярного уровня биология перейдет на атомарный уровень. Однако сейчас не найдется, пожалуй, ни одного исследователя, который мог бы достаточно реально предсказать развитие молекулярной биологии даже на ближайшие 20 лет.
Глава 24
Молекулярная генетика
Исследователями классического периода развития генетики были выяснены основные закономерности наследования и доказано, что наследственные факторы (гены) сосредоточены в хромосомах. Дальнейший прогресс в изучении закономерностей хранения и реализации генетической информации сдерживался по двум причинам. Во‑первых, из‑за слишком объемных экспериментов, связанных с более глубоким изучением генов, во‑вторых, ввиду невозможности понять работу генов без углубленного исследования превращения молекул, вовлеченных в генетические процессы. Достаточно напомнить, например, что для установления дробимости гена исследователям понадобилось только в одном эксперименте просмотреть несколько сотен тысяч дрозофил. Поэтому переход к генетическим исследованиям микроорганизмов, позволивший избежать указанных трудностей, был вполне закономерен. Такой переход к изучению генетических закономерностей на молекулярном уровне осуществился в 50‑х годах.
В 1941 г. Дж. Бидл и Э. Тейтум опубликовали короткую статью «Генетический контроль биохимических реакций у Neurospora», в которой сообщили о первых генетических экспериментах на микроорганизмах (см. об этом в главе 7).
В послевоенные годы эти исследования получили широкий размах и проводятся на самых различных биологических объектах.
Тонкая структура гена.
Одно из наиболее существенных достижений молекулярной генетики заключалось в установлении минимальных размеров участков гена, передающихся при кроссинговере[188] подвергающихся мутации и осуществляющих одну фракцию. Оценки этих величин были получены в 50‑е годы С. Бензером при изучении так называемых rII‑мутаций бактериофага Т4, поражающего кишечную палочку – Е. coli. Эти мутанты дают быстро формирующиеся негативные колонии (бляшки) на бактериальном газоне (отсюда и происхождение термина r‑мутанты – от английского слова rapidly).
Бензер разработал удобный тест для разделения r‑мутантов на три группы (rI, rII и rIII) по способности образовывать бляшки определенной формы на различных линиях Е. coli. В частности, те r‑мутанты, которые дают большие, круглые, прозрачные бляшки на линии Е. coli В и не дают бляшек вовсе на Е. coli К12 (λ), являются rII‑мутантами. Очевидно, это позволяет предельно просто выделять из популяции rII фагов все обратные мутанты, т. е. восстановившие свою способность лизировать клетки Е. coli К12 (λ).
Выделив несколько сотен rII‑мутантов, Бензер для построения генетических карт предпринял всевозможные скрещивания их между собой. Основой для картирования служил широко применяемый в классической (а теперь и в молекулярной) генетике метод трехфакторного скрещивания (метод трех точек). В результате Бензеру удалось с большой точностью расположить в пределах одного rII‑гена несколько сотен различных мутаций.
Среди различных внутригенных мутаций Бензер выделил два класса: точечные мутации (мутации минимальной протяженности) и делеции (мутации, занимающие достаточно широкую область гена). Одно из предположений о природе делеций (нехваток) основывалось на признании возможности выпадения последовательности нуклеотидов в молекуле той или иной длины. То, что делеции на самом деле обусловлены выпадением участков ДНК, было доказано впоследствии различными способами (Е. Буржи, В. Шибальский и др.). Если в классической генетике считалось, что делеции могут возникать только на хромосомном уровне, то теперь стало ясно, что такие мутации существуют и на внутригенном уровне. Кстати, именно делеции и позволили Бензеру резко ускорить процесс картирования мутаций.
Имея набор делеций, отражающих выпадение участков молекулы ДНК, имеющих разную длину, Бензер пользовался ими как своеобразными линейками для определения локализации картируемого гена.
Установив факт существования точечных мутаций, Бензер задался целью определить минимальную длину участка ДНК, передаваемую при рекомбинации. Оказалось, что эта величина составляет не более нескольких нуклеотидов, т. е. нескольких мономеров полимерной молекулы ДНК. Бензер назвал эту величину реконом. В дальнейшем Ч. Яновский (1964) показал, что рекомбинации могут происходить между смежными парами нуклеотидов в цепях ДНК. Следующим этапом было установление минимальной длины участка, изменения которого достаточно для возникновения мутации, иными словами, определение минимального размера точечной мутации (мутона). По мнению Бензера, эта величина равна нескольким нуклеотидам. Однако последующими тщательными определениями было выявлено, что длина одного мутона не превышает размеров одного нуклеотида.
Оставалось выяснить, что представляет собой на молекулярном уровне третья характеристика гена – управление одной функцией. Для решения этого вопроса Бензер воспользовался ранее разработанным цис‑транс‑ тестом, применив его к вирусам. Этот метод состоит в следующем. Требуется узнать, одинаковые или разные функциональные единицы затронуты у двух мутантов. Для этого первый раз мутации используются в транс‑положении, т. е. когда каждая из них расположена в разных гомологичных хромосомах, а второй раз – в цис ‑положении, когда обе находятся в одной гомологичной хромосоме и вторая при этом нормальна. Если при транс ‑положении обе мутации принадлежат одной функциональной единице, то эти единицы в обеих хромосомах будут повреждены. Указанные явления могут быть проиллюстрированы при помощи таблиц, заимствованных из работ Бензера (см. стр. 476 и 477).
Генетическая карта спонтанных rII мутаций, выделенных и картированных С. Бензером (1963).
Каждый квадратик представляет собой отдельный мутант.
Метод картирования мутаций с помощью делеций различной длины по Бензеру (1961).
А – генетическая карта фага Т4 с указанием отдельных генов; Б – использование семи больших делеций (так называемые «замечательные делеции») для выделения большого сегмента, заключающего искомую мутацию; В – дальнейшее ограничение области, заключающей мутацию, в пределах более мелкого сегмента; Г – дальнейшее сушение области, заключающей мутацию, с помощью менее протяженных мутаций; Д – точное картирование мутаций, попавших в сегмент А5с2а2, с помощью рекомбинационного анализа (методом трехфакторного скрещивания).
Если же мутации принадлежат двум разным функциональным единицам, то на первой хромосоме будет работать не затронутая мутацией вторая функциональная единица, а на второй хромосоме будет работать нормальная первая функциональная единица:
Пользуясь этим методом, можно вывести заключение о функциональных единицах, участвующих в формировании данного признака. Сравнивая результаты, полученные в обоих случаях, с результатами экспериментов с мутациями в цис ‑положении, можно точно сказать, затронута ли мутацией одна и та же или же разные функциональные единицы. Данный метод позволил Бензеру охарактеризовать все обнаруженные им rII‑мутанты и доказать, что они относятся к двум функциональным единицам. Сами единицы он назвал цистронами. Расчет показал, что в цистрон может входить около тысячи нуклеотидов.
Следующим важным этапом в изучении организации генетического материала было подразделение всех генов на два типа: регуляторные гены, т. е. гены, дающие информацию о строении регуляторных белков (репрессоров) и структурные гены, кодирующие строение остальных полипептидных цепей. Эта идея, а также ее экспериментальное доказательство были разработаны французскими исследователями Ф. Жакобом и Ж. Моно (1961) (см. ниже раздел «Регуляция генной активности»).
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 152; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!