Определение рН питательных сред

Техника приготовления основных питательных сред

Для культивирования микробов в лабораторных условиях готовят питательные среды с учетом потребности в питательных веществах каждого вида в отдельности. Питательная среда в своем составе должна содержать углерод, водород, кислород, азот, фосфор, серу, магний, железо, микроэлементы и биостимуляторы роста.

Различают питательные среды естественные(молоко, яйца, картофель и т. п.),искусственные,приготовленные из продуктов животного или растительного происхождения, исинтетические(среды Чапека, Сабуро). По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Для приготовления плотных сред в жидкие среды добавляют агар-агар или желатин. Агар-агар представляет собой продукт переработки высушенных морских водорослей рода анфельция, состоящий в основном из полисахаридов. В холодной воде агар-агар набухает и размягчается, в горячей (90—100° С) расплавляется, образуя клееобразную массу. Застывает агар-агар при 40° С, образуя студень. Как питательное вещество агар-агар микробами не используется.

Желатин получают путем вываривания кожи, костей и сухожилий животных. При нагревании с водой желатин образует коллоидный раствор, застывающий при 18—20° С в однородный коллоидный студень и расплавляющийся при 25—27° С.

В бактериологической практике обычно применяют среды из продуктов животного и растительного происхождения, содержащие пептоны, экстрактивные вещества мяса, кровь, сыворотку, сусло, углеводы и т. п.

Необходимые питательные вещества должны содержаться в среде в доступной форме и в определенных соотношениях.

Питательные среды должны быть стерильными (должно быть обеспечено получение чистых культур микроорганизмов), прозрачными (выросшие на них микроорганизмы должны быть хорошо видны и иметь определенную величину рН).

Хранят готовые среды в прохладном месте, в плотно закрывающихся шкафах или ящиках, что предохраняет их от быстрого высыхания. Надолго хранившихся средах микробы развиваются слабо или совсем не растут.

Питательные среды принято делить на три группы:

1) стандартные (универсальные) — предназначаются для культивирования большинства микробов;

2) специальные элективные, избирательные — предназначаются для выращивания только определенного вида микробов, рост других микроорганизмов на этих средах подавляется;

3) дифференциально-диагностические — предназначаются для изучения биохимических свойств микробов с целью дифференцирования различных видов микроорганизмов.

Стандартные питательные среды

Мясопептонный бульон (МПБ).В состав МПБ входят мясная вода, пептон и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в прохладное место (4—6° С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в течение часа, дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество жира, который необходимо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками, пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20—30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством дистиллированной воды . Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты (рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его. После остывания застывший плотный агар вынимают из посуды и отрезают нижнюю часть, содержащую осадок. Затем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм. После стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в вертикальном положении. Если нужно приготовить агар скошенной формы, пробирки с расплавленным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды (рис. 2). При этом пробирки необходимо предохранять от действия солнечного света.

Мясопептонный желатин (МПЖ).К мясопептонному бульону добавляют 10% зимой и не менее 18—20% летом измельченного желатина и подогревают в текучепаровом аппарате до полного растворения желатина. Подщелачивают среду до рН 7,2 путем добавления 10%-ного раствораNaОН. После охлаждения до 60° С осветляют яичным белком (в таком же количестве, как и для МПА), подогревают в текучепаровом аппарате 20—30 мин. В горячем виде фильтруют через ватный или марлевый фильтр и разливают по пробиркам. Стерилизуют дробно по 15—20 мин три дня подряд при температуре 100° С.

Картофельная среда.Отбирают крупный картофель, промывают щеткой под водопроводной водой, удаляют кожуру и поврежденные места. Клубни снова моют под струей водопроводной воды и помещают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 2—3 ч для нейтрализации кислой среды. Из картофеля пробником вырезают столбики, диаметр которых должен соответствовать ширине пробирок. Столбики помещают в чашки с водой и разрезают по диагонали на две части, подсушивают фильтровальной бумагой и половинки помещают в пробирки с перехватом внизу (в нижнюю часть этих пробирок стекает вода, выделяемая при стерилизации). За неимением специальных пробирок используют обычные пробирки, поместив на дно стеклянные или деревянные палочки, а на них — картофель. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20—25 мин.

Пептонная вода. Приготовляют ее различными способами. В 1 л дистиллированной воды растворяют 5 г химически чистой поваренной соли и 10 г пептона и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 10 мин. Для выращивания гнилостных бактерий пептонную воду готовят несколько иначе: в 1 л дистиллированной воды растворяют 30 г пептона. Стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Концентрированная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 100 г пептона и 50 г поваренной соли, нагревают до кипения, отфильтровывают, добавляют 50 г глюкозы, устанавливают рН 7,4— 7,6 (с помощью насыщенного раствора углекислой соды), разливают по 10 мл в колбы и склянки емкостью 250 мл с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром. Разведенная глюкозопептонная среда. В 1 л воды растворяют 10 г пептона и 5 г поваренной соли, нагревают до кипения и добавляют 5 г глюкозы. Устанавливают рН среды 7,4—7,6, разливают по 10 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют 3 дня по 30 мин текучим паром.

Сухой питательный агар. Содержит рыбный или мясной бульон, агар, хлористый и фосфорнокислый натрий. К 5 г порошка агара добавляют 100 мл холодной дистиллированной воды. Тщательно взбалтывают и нагревают при помешивании до полного растворения агара, не допуская пригорания. По мере надобности раствор фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин.

Специальные (элективные) питательные среды

Среды для выращивания анаэробных микробов. Мясопептонный печеночный бульон Кита - Тароцци (МППБ). Свежую или замороженную печень (лучше крупного рогатого скота) режут на мелкие куски, заливают равным по массе количеством водопроводной воды, варят в течение часа, фильтруют через вату и добавляют к 1 части полученного экстракта 3 части мясопептонного бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют химически чистую поваренную соль (на 1 л среды 1,25 г) и доводят рН до 7,6—7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный или увлажненный ватный фильтр. К профильтрованному бульону добавляют мелко нарезанные кусочки (по 1,5— 2 г) печени, из расчета на 1 л бульона 100 г печени (печень предварительно очищают от пленок и промывают водой). В пробирку помещают несколько таких кусочков, наливают высоким столбиком 7—10 мл бульона, на поверхность его наслаивают вазелиновое или парафиновое масло.

Бульон с кусочками печени стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 мин. С целью удаления из пробирки кислорода перед посевом среду кипятят 10 мин и быстро охлаждают водой.

Полужидкий агар для анаэробов. К МПБ добавляют 0,25—0,75% агар-агара и 1% глюкозы; рН среды 7,4. Среду разливают высокими столбиками в пробирки. Стерилизуют дробно текучим паром по 15—20 мин в течение 3 дней.

Среды для выращивания молочнокислых бактерий. Молоко (цельное).Нагревают до кипения. Наливают в тубусную склянку и ставят на 10—20 ч в холодное место для отстаивания сливок. По истечении этого времени через кран тубуса разливают обезжиренную часть молока по пробиркам, закрывают ватными пробками. Стерилизуют дробно при 100° С три дня по 20 мин или при 112° С однократно 30 мин.

Обезжиренное молоко. Для получения обезжиренного молока цельное молоко сепарируют и далее поступают так же, как при использовании цельного молока.

Гидролизованное молоко (по Богданову).Берут 1 л прокипяченногои остуженного до 45° С обезжиренного молока, устанавливают рН 7,6—7,8, добавляют 0,5 г порошка панкреатина (разведенного предварительно в небольшом количестве теплой воды) или 2—3 г измельченной поджелудочной железы и через несколько минут 5 мл хлороформа. После этого бутыль тщательно встряхивают, плотно закрывают корковой пробкой и помещают на 3 суток в термостат при температуре 40° С при ежедневном встряхивании жидкости. По истечении указанного срока с целью удаления хлороформа бутыль открывают, жидкость фильтруют и разбавляют в 2—3 раза водопроводной водой. Доводят рН среды до 7,0— 7,2 и стерилизуют.

Агар из гидролизованного м о л о к а.К гидролизованному молоку прибавляют 1,5—2% агара, расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПав течение 15 мин. На этой среде хорошо растут молочнокислые палочки.

Сывороточный агар. На 100 мл водопроводной воды берут 7,5 г агара, кипятят до полного растворения, добавляют воды до первоначального объема (т. е. в объеме, равном объему испарившейся воды), прибавляют 400 мл заранее приготовленной молочной сыворотки, подвергают действию текучего пара в течение 30 мин, фильтруют через слой ваты, разливают по пробирками стерилизуют под давлением 0,05 МПа в течение 30 мин.

Капустная среда. 200 г измельченной капусты (или люцерны) заливают 100 мл воды и кипятят в кастрюле 10 мин, отжимают через двойной слой марли. Полученную жидкость фильтруют и разводят в 2 раза водопроводной водой. Добавляют 2% глюкозы и 1% пептона, разливают по пробиркам и стерилизуют три избыточном давлении 0,05 МПа в течение 15 мин.

Среда для выращивания осмофильных дрожжей. Примерно в 1 л дистиллированной воды вносят 200 г предварительно подогретого меда, 1 г двуфосфорнокислого калия, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г виннокислого аммония, 0,1 г хлористого натрия и 0,1 г хлористого калия. Все компоненты смешивают и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среда для выращивания галофилов. Используют обычные мясопептонные среды с добавлением от 10—15 до 20—30% поваренной соли. Кроме того, при изготовлении плотных питательных сред увеличивают и процентное содержание агара. Стерилизацию проводят под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среды обогащения. Среда Мюллера. К 4,5 г химически чистого мела, предварительно простерилизованного сухим жаром, добавляют 90 мл МПБ и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение-20 мин. Готовят: а) раствор гипосульфита (50 г чистого кристаллического гипосульфита заливают до 100 мл дистиллированной водой, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин); б) раствор йода (20 г металлического йода и 25 г йодистого калия заливают до 100 мл дистиллированной водой). Перед посевом к бульону с мелом стерильно добавляют 10 мл раствора гипосульфита и 2 мл раствора йода. При добавлении каждого ингредиента смесь взбалтывают. Разливают по стерильным пробиркам или колбам.

Среда Киллиана. К 100 мл обычного МПБ стерильно добавляют перед использованием 1 мл водного раствора (1:1000) бриллиантового зеленого.

Дифференциально-диагностические (цветные) питательные среды

Среда Эндо. К 100 мл нейтрального расплавленного 3%-ного мясопептонного агара прибавляют 1 мл 10%-ного водного раствора кристаллического углекислого натрия, выдерживают в текучепаровом аппарате в течение 10 мин при температуре 100° С, охлаждают до 60° и стерильно прибавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл стерильной воды, и смесь фуксина с безводным сульфитом натрия. Смесь готовят следующим образом. Растворяют 0,5 г сульфита натрия в 5 мл стерильной воды и добавляют к 1 мл насыщенного спиртового раствора основного кристаллического фуксина до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной или слегка розоватой. Обесцвеченную смесь фуксина с сульфитом добавляют к расплавленному агару, и последний принимает розоватый цвет. После тщательного перемешивания (следят за тем, чтобы не образовывалась пена) среду разливают по чашкам. При остывании среда делается цветной, в толстых слоях имеет розоватый оттенок. На этой среде можно легко отличить кишечную палочку, паратифозных бактерий.

Готовят среду перед посевом. Во избежание покраснения ее защищают от света. Выпускается в виде сухого порошка. Способ приготовления указывается на этикетке.

Среда Гисса. Для изготовления индикатораАндредэ берут 100 мл дистиллированной воды, 0,5 г фуксина кислого и 16 мл 4%-ного водного раствора едкого натра. Выдерживают на водяной бане 10 мин. Хранят в темном месте.

Среду с индикатором Андредэ приготовляют следующим образом. Готовят пептонную воду. Для этого берут 1% пептона и 0,5% поваренной соли на определенный объем дистиллированной воды. Кипятят до растворения пептона, фильтруют через бумажный складчатый фильтр, устанавливают рН 7,0—7,2. После подщелачивания 10%-ным раствором NаОН снова кипятят в течение 10 мин, фильтруют и к готовой 1%-ной пептонной воде (рН 7,0—7,2) добавляют 1% индикатора Андредэ. К среде с индикатором добавляют требуемые углеводы или многоатомные спирты в количестве 0,5% — 1% (лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит, дульцит и др.). Среды разливают по пробиркам, снабженным для учета образования газа бродильными трубочками. Вместо трубочек иногда помещают кусочки ваты — 0,02 г на пробирку. Проводят дробную стерилизацию при температуре 100° С в течение 20 мин три дня подряд.

Правильно приготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет.

Среда Кесслера. В 1 л водопроводной воды вносят 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Кипятят на водяной бане 15 мин, постоянно взбалтывая. После полного растворения среду фильтруют через вату и добавляют 10 г лактозы. Доводят рН до 7,7. К 1 л среды добавляют 4 мл 1 %-ного водного раствора генцианвиолета и разливают в пробирки с поплавками. Стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Определение рН питательных сред

Для культивирования микробов на искусственных питательных средах особое значение имеет концентрация водородных ионов, так как каждый вид микроба может развиваться только при определенной кислотности или щелочности. Большинство бактерий приспособлено к росту и размножению в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7,0—7,6).

Для определения реакции питательной среды применяют два метода: электрометрический (с помощью рН-метра) и колориметрический. В лабораторной практике чаще всего используется наиболее простой колориметрический метод по Михаэлису, основанный на изменении цвета индикатора вследствие диссоциации его в зависимости от концентрации водородных ионов в среде. При определении рН по Михаэлису применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Ввиду того, что для выращивания микробов готовят среды слабощелочной реакции, при определении рН среды в качестве индикатора используют метаннитрофенол, который позволяет определять рН в пределах от 6,8 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Дата добавления: 2020-04-08; просмотров: 2493; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

Мы поможем в написании ваших работ!