Векторы на основе аденовирусов
Аденовирусы содержат линейную двухцепочечную ДНК и способны к репродукции независимо отделения клетки-хозяина. Аденовирусные векторы позволяют доставлять гены в различные ткани человека, в том числе в эпителий дыхательных путей, эндотелий, миокард и скелетные мышцы, клетки периферической и центральной нервной системы, гепатоциты, экзокринные клетки поджелудочной железы и различные типы опухолей. Известно более 40 серотипов аденовирусов человека, а вызываемые ими заболевания подробно описаны. Почти все взрослые люди перенесли аденовирусную инфекцию, и в их крови имеются антитела против аденовирусов.
Аденовирусные векторы обеспечивают эффективную трансфекцию как делящихся, так и неделящихся клеток с последующей экспрессией трансгенов. Можно использовать разные пути введения, например в/в, внутрибрюшинный, внутрипузырный, внутричерепной, интратекальный, а также инъекцию в желчные пути или непосредственно в паренхиму органа. Многообразие путей введения позволяет выбрать наилучший для выбранной мишени. Аденовирусные векторы имеют два существенных недостатка. Во-первых, после заражения клетки вирусный геном не встраивается в ДНК клетки, поэтому длительной экспрессии трансгена не происходит. Во-вторых, аденовирусная инфекция активирует как клеточное, так и гуморальное звенья иммунитета, что ведет к уничтожению трансфицированных клеток и снижает эффективность повторного введения вектора. Побочные эффекты аденовирусных векторов также объясняются иммунным ответом.
|
|
|
Применение. В настоящее время проводится много клинических испытаний, в которых аденовирусные векторы применяют для лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний. При лечении наследственных заболеваний большим недостатком является непродолжительность экспрессии трансгенов и иммунный ответ на зараженные клетки. Внехромосомная локализация аденовирусного генома в клетке ограничивает продолжительность экспрессии трансгенов в активно делящихся клетках (например, клетках костного мозга или эпителия), так как деление клеток не сопровождается репликацией трансгена. Аденовирусные векторы, как способные, так и не способные к репродукции, могут найти применение в лечении злокачественных новообразований.
Безопасность. Основное побочное действие аденовирусных векторов - иммунный ответ, направленный против зараженных клеток. Обсуждение безопасности аденовирусных векторов особенно стимулировала смерть одного больного во время клинических испытаний. Имеются также сомнения, что в процессе получения вектора полностью исключено образование рекомбинантного вектора, способного к репродукции.
|
|
|
Аденоассоциированные вирусы
Эти маленькие, лишенные оболочки вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК, обладают рядом свойств, необходимых хорошему вектору. Они непатогенны, обеспечивают эффективную и стабильную трансфекцию неделящихся клеток, а кроме того, позволяют исключить экспрессию вирусных белков в зараженных клетках. Основные недостатки аденоассо-циированных векторов - маленькая емкость и трудности в концентрировании.
Жизненный цикл. Для репродукции аденоассоциированные вирусы нуждаются в генетической информации вируса-помощника. В жизненном цикле аденоассоциированных вирусов выделяют две фазы. Такой вирус заражает клетку, включается в клеточный геном и в отсутствие вируса-помощника (аденовируса) остается там продолжительное время в латентном состоянии. В присутствии аденовирусов начинается активная фаза, приводящая к репродукции аденоассоциированного вируса и лизису клеток. Геном аденоассоциированного вируса содержит две открытые рамки считывания (гер и cap), ограниченные инвертированными концевыми повторами (ITR). Для репродукции вируса нужны только гены гер, кодирующие четыре белка, которые обеспечивают репродукцию аденоассоциированного вируса, транскрипцию вирусной ДНК и эндонуклеазную активность, необходимую для встраивания в клеточный геном. Структурные белки, образующие капсид вируса, кодируются геном cap. В районе инвертированных концевых повторов находятся точки начала репликации; эти повторы содержат сигналы для сборки вирусов, а также участвуют во встраивании вирусной ДНК в клеточный геном. Функция многих белков и другие особенности биологии вируса стали известны после изучения природных немодифицированных вирусов.
|
|
|
Заражение начинается с прикрепления вируса к его основному рецептору на клетке - протеогликану, содержащему гепарансульфат. В проникновении вируса в клетку участвуют также рецептор фактора роста фибробластов и сц, Р5-интегрин. Интернализация вируса осуществляется путем эндоцитоза через образование покрытых клатрином окаймленных ямок. Внутри клетки геном аденоассоциированного вируса замыкается в кольцо и образует кольцевые конкатемеры, находящиеся вне хромосом. Образование этих кольцевых форм вирусного генома сопровождается длительной экспрессией трансгена. Природный аденоассоциированный вирус может встраиваться в ДНК человека на одном участке 19-й хромосомы (19q 13.3-qter). Рекомбинантный вирус иногда утрачивает эту способность. Конструкция и получение вектора. Существующие аденоассоциированные векторы получают с помощью системы трех рекомбинантных плазмид. Первая плазмида содержит трансген, расположенный между двумя инвертированными концевыми повторами, вторая - гены гер и cap, а третья - участки генома аденовируса, необходимые для сборки аденоассоциированного вируса. Этот подход позволяет обойтись без дополнительного заражения продуцирующих клеток аденовирусом. Из-за небольшого размера генома аденоассоциированных вирусов в вектор можно включить не более 5200 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Это не только ограничивает размер потенциального трансгена, но и затрудняет использование специальных промоторов и энхансеров, регулирующих его экспрессию в зараженной клетке. При использовании двухвекторной системы можно вдвое увеличить емкость вектора: две половины трансгена соединяются in vivo из двух разных векторов, которые объединяются в кольцевой конкатемер внутри клетки. Таким же образом можно собирать большие гены или включать важные регуляторные элементы, слишком большие для одного вектора. В настоящее время основные проблемы в использовании аденоассоциированных векторов связаны с трудностями получения высокой концентрации вектора и определения его титра. Клетки-мишени. Аденоассоциированные векторы способны заражать различные клетки. В доклинических исследованиях показана эффективная трансфекция клеток скелетных мышц, ЦНС, легких, печени, ЖКТ и глаза.
|
|
|
Применение. Аденоассоциированные векторы начали применять в клинике: сейчас проводятся клинические испытания доставки генов в легкие и в скелетные мышцы. По-видимому, эти векторы подходят для обеспечения длительной экспрессии трансгенов в скелетных мышцах, сердце, ЦНС и других тканях. Первые результаты клинического испытания, в котором с помощью аденоассоциированного вектора осуществляли доставку гена фактора IX в скелетные мышцы больных гемофилией, оказались успешными (см. ниже). Способность этих векторов обеспечивать длительную экспрессию трансгенов, не оказывая токсического действия на клетки и не вызывая иммунного ответа, делает их перспективным инструментом лечения некоторых наследственных заболеваний.
Безопасность. Аденоассоциированные вирусы непатогенны. Первые опыты с использованием соответствующих векторов показали, что они не активируют иммунную систему. Раньше высказывались опасения, что аденоассоциированный вектор может быть загрязнен вирусом-помощником (аденовирусом), но этот риск ликвидировали новые схемы получения векторов. Наконец, аденоассоциированные векторы могут встраиваться в геном клетки случайным образом, что теоретически может привести к инсерционному мутагенезу. Вероятно, необходимо сохранить в векторах способность специфического встраивания в 19-ю хромосому
Герпесвирусы
Этот вирус содержит большую (152 000 пар нуклеотидов) молекулу двухцепочечной ДНК, которая реплицируется в ядре зараженной клетки. Вирус заражает различные клетки, как делящиеся, так и неделящиеся; вирусный геном находится вне хромосом. В вирусный геном путем гомологичной рекомбинации или путем делеции и вставки можно встроить до 20 000-30 000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Вирус простого герпеса типа 1 обладает тропностью к нейронам, поэтому его предложено использовать в качестве вектора для генотерапии нервных болезней, например болезни Паркинсона или злокачественных новообразований мозга. Основные недостатки такого вектора - цитотоксичность и возможность замолкания трансгена.
Жизненный цикл. Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса типа 1, может быть активной, приводящей к лизису клеток, или латентной. При первичном заражении вирус проникает в клетки эпителия (кожи или слизистых), где репродуцируется. Новые вирусы, покидая зараженную клетку путем отпочковывания, получают внешнюю оболочку, состоящую из остатков клеточной мембраны. Затем вирусы внедряются в чувствительные нервы вблизи от очага первичной инфекции и ретроградно транспортируются по волокну в тело нейрона. В прикреплении вируса участвуют молекулы гепарансульфата, расположенные на поверхности клеточной мембраны. Попав в тело нейрона, вирус может продолжить активную репродукцию или перейти в латентное состояние. В последнем случае подавляется экспрессия большинства вирусных генов, но два промотора (LAPI, LAP2) активируют синтез транскриптов, связанных с латентностью (LAT-транскриптов). Позже вирус может реактивироваться, начать активную репродукцию и распространиться на очаг первичной инфекции или ЦНС.
Конструкция и получение вектора. Герпесвирусный вектор не способен к репликации, поскольку у него нет нескольких необходимых для этого генов, таких, как сверхранние гены ICP4, 1СР22и ICP27. Удаление этих генов уменьшает также цитотоксичность вектора и увеличивает продолжительность экспрессии трансгена. Были разработаны методы, позволяющие без использования вирусов-помощников получить герпесвирусные векторы, хотя и с невысоким титром. Такие векторы способны заражать нервные клетки in vivo, не повреждая их. Наиболее эффективные способы получения вектора на основе вируса простого герпеса типа 1 позволяют включить в него два независимых трансгена.
Большим препятствием к использованию герпесвирусных векторов является кратковременность экспрессии, вызванная замолканием трансгена. Перспективный способ преодоления этой проблемы - использование промоторов, активирующих синтез LAT-транскриптов. Иногда для облегчения трансляции трансген сшивают с внутренним сайтом связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита.
Клетки-мишени. Вирус простого герпеса типа 1 способен заражать различные клетки человека, но особенно выражена его тропность к нейронам. Для повышения специфичности удаляют вирусные гены, кодирующие гликопротеид (обеспечивает прикрепление к клетке); их можно заменить на другие аналогичные гены.
Применение. Емкость герпесвирусных векторов очень велика. Например, с их помощью в культуру мышечных клеток, полученных от мышей с экспериментальной мышечной дистрофией, была введена полная кДНК дистрофина из 14 000 пар нуклеотидов. Способные к репродукции герпесвирусные векторы сейчас разрабатываются для лечения злокачественных новообразований мозга и других органов. Безопасность. Основная опасность герпесвирусных векторов - цитотоксичность. Новейшие способы получения векторов, включающие удаление дополнительных вирусных генов, снижают этот риск.
Дата добавления: 2020-01-07; просмотров: 925; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!