Материально-техническое обеспечение метода

Оборудование:

· стандартное оборудование для бактериологических лабораторий;

· стандартное оборудование для серологических лабораторий;

· стандартное оборудование для иммунологических лабораторий.

Диагностические наборы:

· сыворотки диагностические к Y. enterocolitica и Y. pseudotuber­ culosis распространенных сероваров О-моновалентные кроличьи сухие для РА на стекле;

· сыворотка диагностическая к вирулентным Y. enterocolitica адсорбированная сухая кроличья для РА на стекле (СВИ);

· «Тест-система иммуноферментная для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза I серотипа»;

· наборы для ПЦР Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica;

· диагностикум латексный для выявления Yersinia pseudotuberculosis;

· диагностикум эритроцитарный псевдотуберкулезный антигенный сухой;

· диагностикум эритроцитарный кишечноиерсиниозный О : 3 анти­генный сухой;

· диагностикум эритроцитарный кишечноиерсиниозный О : 9 анти­генный сухой.

Питательные среды:

· питательная среда для выделения возбудителей кишечного иер­синиоза и псевдотуберкулеза, рег. № 96/306/5;

· среда для определения чувствительности к антибиотикам (АГВ) (ФС 42-3521—98);

· агар Хоттингера (МУК 4.1/4.2.588—96, с. 46);

· бульон Хоттингера (МУК 4.1/4.2.588—96, с. 45);

· пептон ферментативный, ГОСТ 138 05—76Е;

· питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (ГНЦПМ, Оболенск), рег. № 98/306/5.

Химические реактивы:

· двузамещеный фосфорно-кислый калий (К₂НРО₄), ГОСТ 2493—75;

· фосфатно-солевой буфер, кат. № В – 60201;

· натрий хлористый, ГОСТ 4233—77;

· калия гидроокись (КОН), СТ СЕВ 1439—78;

· желчь очищенная, сухая, ТУ 480-00001927-24—93;

· глюкоза, ГОСТ 975—88;

· мочевина, 6691—77;

· натрий щавелево-кислый;

· магний хлористый;

· бромтимоловый синий воднорастворимый.

Бактериологический метод

Порядок проведения бактериологического исследования

Одним из важнейших условий качественного проведения бактериологического исследования является правильный сбор материала и его подготовка к исследованию. Правила взятия и подготовки исследуемого материала представлены в табл. 4.

Схема проведения бактериологического исследования включает «обогащение» исследуемого материала при низкой температуре, использование дифференциально-диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их биотипа, серотипа, вирулентности.

Несмотря на низкую эффективность, прямой посев нативного материала на плотные питательные среды проводят, как правило, при подозрении на инфицированность иерсиниями продуктов питания и/или при групповых заболеваниях, вызванных употреблением (инфицированных) продуктов. Для этой цели эффективнее применение дифференциально-диагностической среды для выделения иерсиний с бромтимоловым синим (СБТС).

При проведении «холодового обогащения» исследуемый материал в пептонно-калиевой среде (ПК) помещают в холодильник и выдер­живают в нем до первого положительного посева, но не более 10 дней.

Высев на плотные питательные среды проводят со среды ПК на 2—3, 5—7 и 10-е сутки. Высевы проводят петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. При использовании среды Эндо и/или исследовании загрязненных проб, особенно при массовом поступлении, для ингибирования роста посторонней флоры, проводят щелочную обработку. Методика щелочной обработки основана на относительной резистентности иерсиний к щелочи по сравнению с другими микроорганизмами.

Методика щелочной обработки

Щелочная обработка проб проводится перед каждым высевом со среды ПК на плотную питательную среду. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций вносят по 0,2 мл свежеприготовленного 0,72 %-го раствора КОН в 0,5 %-м растворе NaCl и 0,2 мл исследуемого материала, перемешивают, выдерживают 1—1,5 мин и высевают на СБТС или среду Эндо. Посевы инкубируют при (26 ± 2) °С.

Просмотр выросших колоний проводят, как правило, через 48 ч, учитывая их морфологию (табл. 5).

Биохимическая идентификация

Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают на основании комплекса типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

Для предварительного отбора используют стабильный биохимический признак – наличие уреазы. Положительный уреазный тест позволяет отличить иерсиний от других видов патогенных кишечных бактерий – шигелл, сальмонелл, эшерихий и др. Отсев подозрительных колоний проводят на скошенный столбик среды Олькеницкого штрихом и уколом в столбик. Как и иерсинии, бактерии рода Proteus гидролизуют мочевину, но они, в отличие от Yersinia, всегда расщепляют триптофан.

Ферментативная активность исследуется обычным способом на средах Гисса при 28 °С; подвижность в 0,3 %-м полужидком агаре и реакция Фогес-Проскауэра (среда Кларка) – при 25 и 37 °С.

Таблица 4

Материал для исследования и его подготовка

Вид исследуемого материала	Количество, сроки	Правила взятия, подготовка к исследованию бактериологическим методом и методом ИФА	Правила взятия, подготовка к исследованию в ПЦР
1	2	3	4
Материал от больных
Испражнения*	0,5—1,0 г на протяжении всего периода заболевания	Стерильной деревянной палочкой из судна; ректальным зондом. Поместить в 5,0 мл среды накопления (ПК)	В одноразовый контейнер с 5—10 мл забуференного физ. р-ра (ЗФР) рН 7,2—7,4, ложечкой, прилагаемой к контейнеру
Моча*	20—30 мл средней порции утренней мочи в первые 7 дней болезни	Засевается осадок после центрифугирования или отстаивания; для ИФА осадок исследовать нативно, затем поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовый контейнер
Смыв из зева	В первые 3 дня болезни	Натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченным в физ. р-ре. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления	Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Кровь	5—10 мл в первые 3 дня болезни	Стерильно из локтевой вены; сгусток измельчить, поместить 1 мл в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку
Операционный или секционный материал
Аппендикулярные отростки	1,0—2,0 г	Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Мезентериальные лимфоузлы, др. органы и ткани	1,0—2,0 г	Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Желчь	1,0—2,0 мл	Собрать в пробирку 0,5—1,0 мл, поместить в 5,0 мл среды накопления
* Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3—5 дней болезни и до назначения антибиотиков.

 

Продолжение табл. 4
1	2	3	4
Содержимое кишечника	0,5—1,0 г	Собрать в пробирку 0,5—1,0 мл, поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Сгусток крови	0,5—1,0 мл	Стерильно измельчить, 1 мл поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Материал от животных и птиц
Помет	0,5—1,0 г	Стерильной деревянной палочкой. Поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Тонкий кишечник	1,0—2,0 г	Забирают стерильно участок в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым. Поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Брыжейка, мезентериальные лимфоузлы	1,0—2,0 г	Стерильно измельчить, 1 мл суспензии поместить в 5,0 мл среды накопления	В одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Материал из внешней среды
Пищевые продукты*	25 г	Измельчить, поместить в среду накопления в соотношении 1 : 10, для посева использовать надосадочную жидкость	В одноразовый контейнер ложечкой, прилагаемой к контейнеру
Овощи	10 штук каждого вида	Смыв одним влажным стерильным тампоном с поверхностей на границе здоровой и загнивающей части. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления	Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Смывы с оборудования, инвентаря, тары	10 одноименных поверхностей	Одним влажным стерильным тампоном с поверхностей, площадью 100 см2 каждая. Тампон поместить в 5,0 мл среды накопления	Тампон помещают в одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
Гнезда грызунов	Примерно 10 г субстрата гнезд	Образец растереть в ступке с песком и фосфатно-буферным р-ром. 1,5 мл взвеси внести в 5 мл среды накопления	1,5 мл взвеси в одноразовую пробирку с 5—7 мл ЗФР
* Количество указано в соответствии с требованиями СанПиН 2.3.2.1078—01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
Вода из емкостей для хранения, вода открытых водоемов	Профильтровать через 0,22 мкм бумажный фильтр 1—2 л воды	Фильтры поместить в среду накопления	Фильтры поместить в одноразовые контейнеры с 5 мл ЗФР
Почва	50—100 г	Помещают в среду накопления в соотношении 1 : 10, для посева использовать надосадочную жидкость	В одноразовый контейнер ложечкой, прилагаемой к контейнеру с 5 мл ЗФР

Таблица 5

Характеристика колоний иерсиний на плотных питательных средах

Вид	Среда Эндо		Среда Хоттингера		СБТС		Примечание
	24 ч	48 ч	24 ч	48 ч	24 ч	48 ч
Yersinia pseudotuberculosis	Колонии мелкие (росинчатые) круглые, выпуклые, блестящие, бесцветные	Колонии диаметром 0,1— 0,2 мм, крупные, выпуклые, блестящие с ровными краями, бесцветные	Колонии диаметром 0,1—0,2 мм, голубовато-белые, полупрозрачные с ровными краями, сли­зистые со слабоприподнятым центром (под микроскопом име­ют вид пира­мид или со сходящимися к центру гранями)	Колонии диаметром 0,2—0,5 мм, прозрачные с ровным краем. В полиморфной популяции – часть колоний бугристая с неровными фестончатыми краями	Колонии мелкие, круглые, могут иметь слегка желтоватую окраску	Колонии диаметром 1—2 мм, голубовато-зелено­ватые, с фестончатыми кра­ями, выпуклые с приподнятым центром и суховатой матовой поверхностью на си­нем фоне среды	На СБТС через 48 ч колонии E . с oli – ярко-желтые, диаметром 2—3 мм, сочные, выпуклые; Sh . flexneri – желтые, диаметром 1—2 мм сочные, плоские
Yersinia enterocolitica	Такие же	Такие же, но с розоватым оттенком	Колонии диаметром 0,1—0,2 мм до 0,5 мм, круглые, вы­пуклые с ров­ным краем, полупрозрачные с голубоватым оттенком мягкой консистенции	Колонии диаметром 0,3—0,5 мм более выпуклые, с ровным краем, прозрачные		Колонии диаметром 2—4 мм, голубовато-зеленоватые, выпуклые, сухие, с матовым налетом

Y. pseudotuberculosis отличаются от Y. enterocolitica по отношению к сахарозе и рамнозе.

Тесты расширенного биохимического ряда – ферментация ксилозы, сорбита, салицина и образование индола – позволяют определить биотип Y. enterocolitica.

В табл. 1 приведены основные биохимические тесты, позволяющие дифференцировать иерсиний от других микроорганизмов, имеющих с ними сходство, а также определить их видовую принадлежность и биотип Y. enterocolitica.

Серологическая идентификация

Серотипированию подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к виду Y. enterocolitica и/или Y. pseudotuberculosis. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к Y. enterocolitica серогрупп, О : 3; О : 4; О : 4, 32; О : 4, 33; О : 5; О : 5, 27; О : 6, 30; О : 6, 31; О : 7, 8; О : 9; О : 13; О : 13, 7 и другие; к Y. pseudotuberculosis I и III серотипов.

Идентификация вирулентных иерсиний

Среди методов обнаружения вирулентных иерсиний для рутинной практики, наиболее адекватными являются:

1. Фенотипические методы, основанные на выявлении признаков вирулентности, связанных с функционированием плазмиды pYV 42—48 МDа, прежде всего аутоагглютинации и кальцийзависимости роста иерсиний.

Определение способности к аутоагглютинации

Феномен аутоагглютинации проявляется при культивировании в жидкой среде и состоит в спонтанном склеивании клеток иерсиний.

Для посева используют чистые культуры иерсиний. Засевают 10⁶—10⁸ кл/мл в 2 пробирки со средой Кларка, одну из которых инкубируют при температуре (37 ± 1) °С, другую – при (26 ± 2) °С в течение 24—48 ч.

При положительном результате pYV+ иерсинии образуют рыхлый хлопьевидный осадок в первой пробирке (при (37 ± 1) °С); во второй пробирке – равномерное помутнение, осадок чаще не большой, компактный. При отрицательном результате рост pYV– иерсиний создает в обеих пробирках равномерное помутнение среды, хлопья отсутствуют.

Определение кальцийзависимости роста иерсиний

Данное свойство проявляется в ограничении роста бактерий (бактериостаз), наступающем при дефиците ионов Са²⁺. Определение проводят на модифицированной среде АГВ (кальцийдефицитный агар) при температуре (37 ± 1) °С. Исследуемые культуры инкубируют на бульоне Хоттингера при (26 ± 2) °С в течение 24 ч, затем засевают на две чашки с кальцийдефицитным агаром, одну из которых инкубируют при температуре (37 ± 1) °С, другую – при (26 ± 2) °С в течение 48 ч.

При положительном результате pYV+ колонии, выросшие при температуре (37 ± 1) °С, значительно мельче (до 1 мм), чем при (26 ± 2) °С, или отсутствуют (чаще у возбудителя псевдотуберкулеза). При отрицательном результате размеры pYV– колоний как при (37 ± 1) °С, так и при (26 ± 2) °С такие же, как на обычных средах.

При идентификации вирулентных иерсиний в качестве контрольных рекомендуется использовать референтные плазмидосодержащие штаммы Y. enterocolitica серотипов О : 3; О : 9 (№ 188 в коллекции ГИСК им. Л. А. Тарасевича и № КМ-33 (201) в коллекции РосНИПЧИ «Микроб»).

2. Специфический агглютинационный тест, основанный на использовании антител к антигенам вирулентности иерсиний (БНМ), детерминируемым плазмидными генами.

Реакция агглютинации (РА) на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям (СВИ) является экспресс-методом, позволяющим дифференцировать вирулентные pYV+ штаммы представителей рода Yersinia от авирулентных. Для постановки РА используют свежевыделенные культуры. Исследуемую культуру выращивают на чашке Петри или в пробирке со скошенным агаром Хоттингера при (37 ± 1) °С в течение 18—24 ч и столько же при (26 ± 2) °С. Далее постановка и учет реакции осуществляется по общепринятой методике (изложена в инструкции по применению).

---

Дата добавления: 2019-11-16; просмотров: 68; Мы поможем в написании вашей работы!

Поделиться с друзьями:

---

---

Мы поможем в написании ваших работ!