Матеріали та методи дослідження
ВПЛИВ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ФЕТАЛЬНИХ НЕРВОВИХ КЛІТИН НА РЕПАРАТИВНІ ПРОЦЕСИ В ПАТОЛОГІЧНО ЗМІНЕНІЙ СІТКІВЦІ
14.01.35 – кріомедицина
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття
наукового ступеня кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Дьомін Юрій Альбертович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедри офтальмології
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоморфології, м. Харків
доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищій державний навчальний заклад України „Українська медична стоматологічна академія ” МОЗ України, завідувач кафедри гістології, цитології і ембріології, м. Полтава
Захист відбудеться "20" травня 2008 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)
Автореферат розіслано "18" квітня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
|
|
|
член-кореспондент НАН України,
доктор медичних наук,
професор
Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. На даний час розроблено біотехнологічні процеси заготівлі, консервування клітин і тканин ембріофетоплацентарного походження в умовах низьких температур (Грищенко В.І., Снурніков О.С., Дьомін Ю.А. 2000; Грищенко В.И., 2001; Гольцев А.Н., 2005).
Вивчено вплив холоду на біологічні об'єкти, розроблена спеціальна кріогенна техніка, яка забезпечує оптимальну програму заморожування, запропоновано захисні засоби, що забезпечують цілість клітин і тканин у життєздатному стані (Грищенко В.И., 2000, 2003; Гольцев А.Н., Бабенко Н.М., 2003; Грищенко В.И. 2006), а також численні кріоконсервовані препарати і схеми їх використання (Anthony D. et al., 1999; Fuchs E. et al., 2000, Сметанкин И.Г., 2000; Bianco P. et al., 2001; Турчин И.С., 2003; Бабенко В.И., Грищенко В.И., 2005; Бичко С.В., Дунаева О.В., 2005; Ващенко В.И., 2005).
Процес кріоконсервування багато в чому визначає функціональну повноцінність біологічного матеріалу і відповідно успіх у практичному його застосуванні.
В останні десятиліття інтенсивно розвивається новий напрямок медицини – клітинна терапія, суть якої полягає в використанні кріоконсервованих клітин і тканин ембріофетоплацентарного комплексу з метою активації компенсаторних ресурсів ушкоджених клітин і тканин реципієнта, стимуляції механізмів регенерації, заміщення утрачених клітинних і тканинних структур при подальшому відновленні функцій органа, тканини (Akpek E.K. et al., 1999; Бабенко Н.Н. и соавт., 1999; Высеканцев И.П., Гурина Т.М., 2001; Демин Ю.А. и соавт., 2001; Ватутин Н.Т., Гринь В.К., 2003).
|
|
|
Однак на даний час залишаються маловивченими механізми дії клітинних препаратів після їх деконсервування і введення в організм реципієнта при різних патологіях. Використання фетальних нервових клітин має виражений позитивний вплив на клінічні синдроми патологічних процесів із ураженням нервової тканини (Линник Л.А., 2001).
Одним з патологічних проявів ураження нервової тканини в офтальмології є центральна хоріоретинальна дистрофія (ЦХРД).
Центральна хоріоретинальна дистрофія – одна найбільш розповсюджена причина слабобачення, яка займає лідируюче місце інвалідності по зору (Линник Л.А., 2001; Абдулаева Э.А.,2002; Александрова М.А., Ревищин А.В., 2003).
За даними вітчизняних вчених ЦХРД складає 14% від усіх випадків судинних захворювань ока, а в осіб старше 50 років – 49% (Бездетко П.А., 2001; Абдулаева Э.А. и соавт., 2002; Александрова М.А. и соавт., 2003). Інвалідність внаслідок дистрофічних захворювань сітківки протягом останніх 5 років залишається високою та складає 24-25% від загальної кількості первинної інвалідності (Логай И.М., Сергиенко Н.М., 2003).
|
|
|
Вибір терапії залежить від форми і стадії ЦХРД. З урахуванням різноманіття патогенетичних факторів захворювання основні методи лікування спрямовані на покращення гемодинаміки і нормалізацію обмінних процесів у судинній оболонці та сітківці. Однак існуючі терапевтичні методи лікування ЦХРД не забезпечують повноцінного і стабільного відновлення утраченого зору і у більшості випадків не мають бажаних задовільних результатів.
Тому актуальним залишається подальший пошук патогенетично обґрунтованих методів лікування ЦХРД, серед яких перспективним є використання препаратів фетоплацентарного комплексу (ПФПК) на основі всебічного вивчення механізмів їх дії.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках науково-дослідної теми Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України: № 7 «Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх кріочутливості та механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування та на моделях деяких патологічних станів» (№ ДР 0102U002026).
|
|
|
Мета і задачі дослідження. Визначити закономірності дії кріоконсервованих фетальних нервових клітин в експерименті і вивчити їх вплив на функціональні показники органа зору в клініці.
Для реалізації поставленої мети необхідно вирішити наступні задачі:
1. Вивчити розподіл кріоконсервованих фетальних нервових клітин (КФНК) в організмі експериментальних тварин після застосування і визначити тимчасові параметри їх функціонування при експериментальній моделі ушкодження сітківки.
2. Оцінити вплив КФНК на морфологічну структуру сітчастої оболонки експериментальних тварин після лазерного опіку ока.
3. Вивчити закономірності впливу КФНК на окремі аспекти молекулярної регуляції процесів репарації сітківки кроля після лазерного опіку.
4. Розробити схему введення КФНК, а також визначити основні верифікаційні параметри для вибору тактики лікування в комплексній терапії ЦХРД.
5. Вивчити динаміку змін основних клініко-функціональних показників органа зору після застосування КФНК у комплексному лікуванні ЦХРД.
Об'єкт дослідження: Процеси репарації ушкодженої сітківки після введення КФНК.
Предмет дослідження: Механізми дії КФНК, які обумовлюють терапевтичну ефективність при лікуванні дистрофічних захворювань та пошкоджень сітківки.
Методи дослідження: У роботі використовували методи морфологічного аналізу, імуноферментний (імуносорбентний) метод для аналізу нейротрофічних факторів (фактора росту нервів (FGN) і трансформуючого фактору росту β-1 (TGF β-1)), молекулярний метод (полімеразно ланцюгова реакція (ПЛР) для дослідження розподілу КФНК в організмі по Y–хромосомі – генетична мітка), метод суправітального фарбування за допомогою флюоресцентного зонда DDC (3,3-'dioctadecyloxacarbocyanine bromide). Також були використані офтальмологічні методи (візометрія, періметрія, електроокулографія, HRT- томографія) і методи статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджені шляхи міграції і встановлені тимчасові параметри функціонування КФНК після їх введення при наявності модельної патології сітківки.
Вивчено вплив КФНК на продукцію нейротрофічних факторів при репарації сітківки у кролів в експерименті.
На основі отриманих експериментальних результатів доповнено знання про механізми дії КФНК, про процеси репаративної регенерації при модельній патології сітківки, а також сформульовані концепції механізмів дії КФНК.
Уперше науково обґрунтовано патогенетично орієнтоване застосування КФНК при лікуванні сухої форми центральної хоріоретинальної дистрофії, та на основі проведених експериментальних досліджень розроблена й обґрунтована схема лікування.
Практичне значення одержаних результатів. При використанні кріоконсервованих фетальних нервових клітин стало можливим одержати позитивні результати лікування дистрофічних захворювань сітківки, які підтверджені статистичними даними. Застосування КФНК сприяє поліпшенню медико-соціальної реабілітації пацієнтів.
На підставі проведених досліджень розроблено методичні рекомендації «Застосування імунобіологічного препарату «Кріоцелл» для лікування дистрофічних захворювань ока», які затверджені МОЗ України, а також оформлено патент „Спосіб комплексного лікування дистрофій сітківки ока”.
Даний метод лікування може бути рекомендований до широкого використання в клінічній офтальмологічній практиці. Отримані нами експериментальні і клінічні дані використовуються на кафедрі офтальмології Харківської медичної академії післядипломної освіти і Харківського національного медичного університету.
Результати досліджень впроваджені в МКЛ №14 ім. Л.Л. Гіршмана (м. Харків), Запорізькій обласній клінічній лікарні, Запорізькому центрі відновлення зору ООО „Візус”, Дніпропетровській обласній клінічній офтальмологічній лікарні.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено патентно-інформаційний пошук та аналіз даних літератури з використанням Internet за темою дисертації, отримано результати експериментальних досліджень, виконано їх первинний аналіз і статистичну обробку.
Автор приймала безпосередню участь у всіх клінічних дослідженнях. Разом із науковим керівником проведено планування експериментальної і клінічної роботи, інтерпретовано отримані результати і сформульовано остаточні висновки.
Експериментальні дослідження проведено самостійно на базах віварію і лабораторій ІПКіК НАН України, ХМАПО. Консультативна допомога при проведенні експериментів була надана професором, д.м.н. Дьоміним Ю.А., с.н.с. Т.М. Шарлай, професором, д.б.н. О.Ю. Петренко, с.н.с., к.б.н. Рязанцевим В.В., к.б.н. Ю.Є. Микулинським, к.б.н. О.А. Щегельською, к.б.н. В.З. Гертман.
Клініко-діагностичні дослідження і лікування хворих дисертант провів самостійно на базі МКЛ № 14 ім. Л.Л. Гіршмана, кафедри офтальмології Харківської медичної академії післядипломної освіти.
В опублікованих разом із співавторами роботах особистий внесок дисертанта полягає:
у роботах [1,4] в оцінці критеріїв клінічної ефективності застосування КФНК при дистрофічній патології органа зору;
у роботі [2] у дослідженні розподілу КФНК після введення в ранній термін спостереження за результатами генетичної мітки при експериментальному лазерному ушкодженні сітківки;
у роботах [3,13] у вивчені та оцінці впливу КФНК на деякі аспекти молекулярної регуляції на основі нейротрофічних факторів (TGF β-1 і GNF) на процеси репаративної регенерації при модельній патології ока у кроля;
у роботі [5] у дослідженні розподілу КФНК, мічених флюоресцентним зондом DDC, при експериментальній травмі ока in vivo протягом тривалого терміну спостереження;
у роботі [6] у морфологічній характеристиці сітківки протягом періоду встановлення після лазерного опіку і введення КФНК;
у роботі [7] у запропонуванні і застосуванні тактики лікування дистрофічної патології органа зору.
у роботі [8] у систематизації клінічного матеріалу.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на наукових форумах: засіданні Харківського наукового суспільства офтальмологів; IV Українсько-польській конференції офтальмологів (Київ, 2003); конференції «Cryo Biomol 2003, Society for Cryobiology» (Коімбра, Португалія, 2003); науково-практичній конференції «Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології» Київ-Луганськ-Харків, 2003 (Луганськ, 2003); конференції „Федоровські читання”, (Москва, 2004, 2005); науково-практичній конференції, присвяченій 130-річчю з Дня народження В.П.Філатова (Одеса, 2005); науково-практичній конференції «Сучасні проблеми глаукоми і патології сітківки» (Запоріжжя, 2006); конференції «Cryo 2006, Society for Cryobiology» (Гамбург, Німеччина, 2006); конференції «Актуальні питання фармакотерапії в офтальмології» (Харків, 2007).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 робіт, з яких: 6 статей у наукових фахових виданнях, 7 тез доповідей на наукових конференціях, 1 патент на корисну модель та 1 методичні рекомендації МОЗ України.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках друкованого тексту, складається з введення, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел. Робота містить 8 таблиць, 38 мікрофотографій. Список використаної літератури містить 274 джерел та складає 30 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження
У роботі були використані 88 статевозрілих кролів породи Шиншила масою 1,5-2,5 кг, які утримувались в стандартних умовах віварію Харківської медичної академії післядипломної освіти при нормальному освітленні і годівлі ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (29.09.01.), що узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).
Для вивчення впливу застосування КФНК на репаративно-регенеративні процеси в сітківці була обрана модель лазерного опіку сітківки (Ченцова Е.В. та співавт., 2005). Лазерне ушкодження сітківки здійснювали за допомогою аргонової лазерної установки Visulas-532 (CARL ZAISS, Німечіна). На нижню половину очного дна кожного експериментального ока через грань 3-дзеркальної лінзи наносили по 10-15 коагулятів. Ушкодженню піддавали праві очі, а контроль здійснювали на лівих очах тварин. Середня потужність випромінювання 400мВт, тривалість експозиції 0,1 сек., діаметр плями 100 мкм. За класифікацією L'еsреrаnсе світловий опік відповідав III ступеню (Ченцова Е.В., Пак Н.В., Иванов А.Н., Сухих Г.Т., 2005).
Для досліджень використали імунобіологічний препарат «Cryocell», розроблений в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків (Грищенко В.І. та співавт., 2001). Сертифікат про державну реєстрацію імунобіологічного препарату «Cryocell» № 371/03-3002 00 000 від 29.05.2003 р. та № 604/06-300200000 від 04.07.2006 р.
Вивчали вплив нейротрофічних факторів на репаративні процеси в сітківці після лазерного опіку.
Неспецифічним ростовим фактором вважали рівень продукції TGF β-1, а специфічним ростовим фактором для нервової тканини – рівень продукції GNF.
Показники продукції нейротрофічних факторів у плазмі крові кролів досліджували на 3, 7, 14, 21-шу добу і у віддалений термін спостереження (один та шість місяців).
Нейротрофічні фактори визначали за допомогою тест – систем: SPECIAL INFORMATION REGARDING BIOTRAK TGF β-1 (Transforming Growth Factor Beta-1) and GNF (Growth Neural Factor) human, ELISA System фірми Аmersham Pharmacia Biotech.
Експерименти проводили на 36 кролях, які розподілили на три групи: 1) перша – інтактна; 2) друга – основна; 3) третя – контрольна.
Інтактна група – кролям не виконували лазерного опіку сітківки. Основна група – внутрішньовенне і парабульбарне введення КФНК після лазерного опіку сітківки. Контрольна група – кролі з мимовільним загоєнням лазерного опіку та група кролів, яким лікування проводили за стандартною схемою: внутрішньовенне введення препаратів милдронату і тренталу, а також їх місцеве введення разом з емаксипіном.
Шлях і час міграції КФНК визначали за допомогою генетичної мітки методом ПЦР. Було використано 21 кроль.
Приготовували зразки клітин, які містять у геномі локус гена SRY, що визначає стать. Спочатку визначали в зразках методом ПЛР присутність локусу гена SRY, і клітини позитивні по Y-хромосомі далі використовували для введення лабораторним самкам кролів.
Клітини, що містять Y-хромосому, вводили кролям парабульбарно в дозі 0,5 мл, з кількістю 20-30×106 ядерних клітин. Проводили забій кролів експериментальних груп через 6, 12, 24 години і на третю добу після застосування КФНК.
За наявністю специфічного фрагмента ампліфікації розміром 336 пар нуклеотидів судили про присутність фетальних клітин з Y-хромосомою в досліджуваних тканинах.
Для ідентифікації і визначення шляхів міграції КФНК після введення використовували метод суправітального фарбування при використанні флюоресцентного зонда DDC, розробленого в НТК „Інститут Монокристалів НАН України (Егоров М.І., Дюбко Т.С., Ліннік Т.П. та співав., 2005; Боровой И.А., Малюкин Ю.В., Семиноженко В.П. , 2006).
У цьому експерименті було використано 15 кролів, по три кроля у кажному періоді спостереження. Перед введенням КФНК проводили суправітальне фарбування клітин розчином барвника DDC і вводили клітини кролям парабульбарно з лазерним опіком в дозі 0,5 мл, з кількістю 20-30×106 ядерних клітин. Забій кролів проводили через 24 години, на 3-, 7-, 14- та 21-шу добу.
Було проведено патоморфологічне дослідження сітківки після ушкодження протягом періоду відновлення у двох експериментальних груп (16 кролів). Попередньо усім тваринам зроблено опік сітчастої оболонки правого ока. Дослідження гістологічних препаратів проводили на 1-, 3-, 7- і 14-ту доби.
Гістологічні препарати виготовляли з парафінових зрізів і фарбували гематоксилін-еозином. Вивчали препарати за допомогою світлової мікроскопії при довжині хвилі 380 нм., на мікроскопі PZO № 21940 (Німечіна) з об'єктивом 20, при окулярі ×15.
Клінічні спостереження. Ми спостерігали за 37 пацієнтами з дистрофічною патологією органа зору (60 очей), внаслідок сухої форми ЦХРД.
Хворі були розподілені на дві групи: контрольна група – 18 пацієнтів (29 очей), у яких лікування проводилось традиційним методом, основна група – 19 пацієнтів (31 око), лікування проводилось з застосуванням КФНК на фоні стандартної терапії.
Усім пацієнтам проводили повне офтальмологічне обстеження: візометрія, периметрія з визначенням сумарного поля зору і центральних скотом, офтальмоскопія очного дна, электроокулографія і ретинальна томографія, які повторювали через 10 діб, один, три і шість місяців.
Для більш детального огляду центральних і периферичних відділів очного дна застосовували налобний офтальмоскоп „Скепенс” його вітчизняний аналог НВО-2 з набором асферичних лінз, ретинальний томограф HRT-II. Для аналізу стану макули використовували програму HRT-II Macula Edema Software (конфокальна лазерна скануюча система для зйомки та аналізу трьохмірних зображень заднього сегмента ока).
Гостроту зору з корекцією та без неї визначали за таблицями Головіна-Сивцева на апараті Рота, сумарне поле зору і площу центральних скотом – на проекційно-реєстраційному периметрі ПРП – 60.
Границі поля зору на біле світло діаметром 3 мм визначали при постійній швидкості пересування об'єкта 1-2 см/сек, у восьми меридіанах із інтервалом 45°.
Окулографію проводили методикою G.B. Arden (1962) при використанні спеціальної камери для обстеження хворого в незатемненій кімнаті. Електроокулографія дозволяє дослідити й оцінити функціональний стан пігментного епітелію і свідчить про рівень кровообігу в хоріокапілярному шарі.
Результати вимірів усіх досліджених показників статистично обробляли за методом Стьюдента, за допомогою критерію Стьюдента визначали рівень вірогідності середнього значення (р<0,95; >0,95; >0,99; >0,999).
Обстежені групи хворих після лікування різними способами представляли у виді дисперсійних комплексів, за допомогою двохфакторного дисперсійного аналізу визначали ступінь впливу різних факторів на результати дослідження.
За допомогою кореляційного аналізу була встановлена наявність і сила зв'язку між парами досліджених показників у процесі лікування і відновного періоду, тобто ступінь зв'язку між рядами регресії, що відбивають динаміку досліджених показників.
Статистичну обробку результатів досліджень робили з використанням комп'ютерних програм “STATGRAPHICS Plus” і “Microsoft Office Excel”.
Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені з комісією з біоетики ІПК і К НАН України.
Дата добавления: 2019-07-15; просмотров: 90; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!