Измерение активности метаболитов
МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Академия биологии и биотехнологии им. Д.И.Ивановского УДК: 575.224.42
ОТЧЕТ
О выполнении НИР магистра по теме
«Антиоксидантное и антимутагенное действие метаболитов растений»
(промежуточный)
Исполнитель НИР ___________________________________ М.В. Миндарь
(дата подпись)
Научный руководитель
Кандидат биологических наук __________________________Е.В. Празднова
(дата, подпись)
Ростов-на-Дону, 2018
SOS -ИНГИБИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАКЦИЙ МЕТАБОЛИТОВ БАЦИЛЛ
Пробоподготовка
1.1 Без проведения хроматографии
1) Осуществляли посев 2-х штаммов бацилл: Bacillus subtilis KATMIRA и Bacillus amyloliquefaciens 1895 в 9 мл полноценной среды Луриа-Бертани (LB) (Маниатис et al., 1984). Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37 °С. Для выращивания на твёрдой среде использовали LB-агар (LB + 20 г/литр микробиологического агара). Посев в жидкую среду осуществляли с целью получения ночной культуры.
2) Производили осаждение клеток, путем центрифугирования культуры клеток в течение 30 мин на центрифуге, при 14 тыс. об/мин, после чего отбирали супернатант.
3) Очищение супернатанта от солей. Осуществляли с использованием концентраторов 2-х типов: на 3кДа и 100 кДа. Добавляли супернатант с культуральной жидкостью к концентраторам и откручивали в течение 30 мин на 14 тыс. об/мин. После чего сливали фильтрат, в концентраторе оставался концентрат, доливали деионизированную воду, чтобы довести объем до 500 мкл и снова центрифугировали. Повторяли данный процесс 3 раза.
|
|
|
4) Полученный концентрат проверяли на наличие возможных протекторных свойств.
1.2 Получение фракций при помощи ионообменной хроматографии
1) Осуществляли посев 2-х штаммов бацилл: Bacillus subtilis KATMIRA и Bacillus amyloliquefaciens 1895 в 7 мл полноценной среды Луриа-Бертани (LB) (Маниатис et al., 1984). Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37 °С. Для выращивания на твёрдой среде использовали LB-агар (LB + 20 г/литр микробиологического агара). Посев в жидкую среду осуществляли с целью получения ночной культуры.
2) После получения ночной культуры осаждали клетки бактерий – откручивали на центрифуге в течение 20 мин на 3 тыс об/мин. После, отобрали надосадочную жидкость и центрифугировали в течение 20 мин. на 14 тыс. об./мин, в пробирках с фильтром на 3 кДА, добавляя буфер, повторяем данный процесс трижды. Оставшийся концентрат используют в ионообменной хроматографии с целью получения фракций.
|
|
|
3) Проведение ионообменной хроматографии.
Ионообменная хроматография - это задержание молекул веществ в неподвижной фазе обусловленное их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. В этом варианте хроматографии задержание происходит в результате электростатического взаимодействия разноименно заряженных ионов. В отличие от абсорбции, ионный обмен описывается стехиометрическим химическим уравнением, что важно и для ионной хроматографии. Однако в ионообменниках часто наблюдается и физическая адсорбция. Разделение в этом случае происходит благодаря разному сродству компонентов определяемой смеси к неподвижной фазе и, следовательно, разным скоростям перемещения по колонке. Ионообменная хроматография широко используется для решения многих биохимических проблем в научных исследованиях.
После проведения ионообменной хроматографии получали некоторое количество фракций:
· из культуральной жидкости штамма : Bacillus subtilis KATMIRA получали 13 фракций;
· из культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens 1895 – 5 фракций.
Полученные фракции исследовали на наличие анти-SOS активности, проводили биолюминесцентный тест.
|
|
|
Проведение биолюминесцентного теста
1) Культуру E. coli MG 1655 pRecA-lux растили на полноценной среде Луриа-Бертани (LB) (Маниатис et al., 1984). Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37 °С. Для выращивания на твёрдой среде использовали LB-агар (LB + 20 г/литр микробиологического агара). Как в жидкую, так и твердую среду добавляли антибиотик ампициллин (100 мкг/мл).
2) Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37 °С до ранней или средней логарифмической фазы. Ночную культуру разбавляли свежей средой до плотности 0,01 - 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3·107- 3·106 клеток/мл).
3) Измерения проводились при помощи денситометра DEN-1B («Biosan»). Затем суспензию подращивали в течение 2 до ранней логарифмической фазы. Аликвоты этой культуры (по 80 мкл) переносили в ячейки планшета и добавляли в них по 10 мкл тестируемого препарата и по 10 мкл контрольного индуктора (кроме контрольных ячеек). В контрольные ячейки добавляли по 10 мкл H2O.
4) В качестве индуктора для активации recA-промотора использовался раствор ципрофлоксацина (pharmaceutical grade, KRKA, Slovenia) в деионизированной воде в концентрации 10-3 мг/мл.
|
|
|
Измерение активности метаболитов
Планшет с пробами помещали в люминометр и инкубировали при 37 °С. Интенсивность биолюминесценции измерялась каждые 10 мин.
Для измерений люминесценции использовался микропланшетный люминометр ЛМ-01T (Immunotech co.).
Фактор индукции SOS ответа (Is) вычисляли по формуле:
(1)
где: Lk – интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах);
Le – интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах).
Признаком статистической значимости эффекта SOS-индукции считали статистически значимое превышение Le над Lk, оцениваемое по t-критерию, рассчитанному с помощью программы EXCEL .
Показатель AntiSOS активности (А, %) вычисляли по формуле:
(2)
где: Ia – фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствии ингибитора.
Ip- фактор индукции SOS-ответа ципрофлоксацином.
Все эксперименты проводили в трех независимых повторностях.
Результаты
Дата добавления: 2019-02-22; просмотров: 125; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!