Каждый из этих подходов имеет свои достоинства и недостатки и выбирается исследователем исходя из объекта, задач и бюджета научного проекта.
В первом случае ДНК получается высокомолекулярной (фрагменты молекул имеют длину более 15000 нуклеотидных пар), однако возможны значительные потери ДНК, остаточные загрязнения протеинами, фенолом и хлороформом – сильными ингибиторами ПЦР. Используемые реагенты высокотоксичны.
При использовании методов, основанных на нуклеосорбции, ДНК имеет высокую степень очистки, однако, возможна ее сильная фрагментация, а остаточные количества сорбента в конечном растворе ДНК также могут ингибировать ферментативные реакции. В настоящее время крупными разработчиками наборов и систем для выделения ДНК используется принцип сорбции ДНК на сорбенте, запрессованном в микроколонку для центрифугирования, существенным недостатком таких наборов являются их высокая стоимость и потери ДНК после многократных промывок колонки, необходимых для удаления примесей.
Метод DiamondDNA, подобно первому методу, позволяет выделять большое количество высокомолекулярной ДНК, но значительно более скор и безопасен.
Далее приводится ряд протоколов классических методов экстракции и очистки ДНК из объектов растительного и животного происхождения.
Выделение ДНК с использованием четвертичного аммониевого основания с последующей экстракцией хлороформом (СТАБ) Использовали собственную модификацию метода. Для этого к образцам ткани печени, селезёнки, мышц и сердца массой ~10 мг внесли 250 мкл СТАБ- буфера (1,4 М NaCl, 0,1 М Tris HCl, 20 mM EDTA, 2% СТАБ). Образцы инкубировали 30 мин при t=65°С. К охлаждённой до комнатной температуры суспензии добавляли 250 мкл смеси хлороформ/ изоамиловый спирт. Содержимое мешали на вортексе, после чего осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 13000 об/мин при комнатной температуре. После этого пипеткой перенесли супернатант в новую пробирку и добавили 50 мкл 5х СТАБ (5% СТАБ, 320 mM EDTA) и инкубировали в течение 10 мин при 65°С. Далее добавили 200 мкл хлороформа, тщательно перемешали и центрифугировали при тех же оборотах. Затем добавили 2 объёма буфера для преципитации (1% СТАБ, 50 mМ TrisCl, 10 mM EDTA), перемешали и оставили на ночь в холодильнике. Спустя ночь добавили 0,7V изопропанола, перемешали, инкубировали 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали. Супернатант отбрасывали, а полученный осадок ДНК промывали 250 мл 80% этанолом и центрифугировали. После промывки этанолом полученную ДНК переосаждали: преципитат растворяли в 50 мкл HS-TE (1M NaCl, 10 mМ Tris Cl, 1 mM EDTA), после чего добавляли 150 мкл 80% этанола и инкубировали 30 мин при -70°С. После инкубации центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин, отбирали этанол и осадок растворяли в 50 мкл ТЕ.
|
|
|
4. Выделение ДНК с использованием фенольно- хлороформной экстракции Выделение ДНК проводили по следующему протоколу: Образцы ткани печени, селезёнки, мышц и сердца массой ~10 мг растирали до гомогенного состояния в 700 мкл буферного раствора (100 mМ NaCI, 10 mM Tris CI pH8,2, 1 mM EDTA, 1% SDS, 2% Triton X-100, H2O). Добавляли 20 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл), перемешивали и инкубировали при 56оС 30 мин. Далее добавляли 300 мкл фенола, тщательно перемешивали и центрифугировали при 13 000 об/мин 5 мин, переносили верхнюю фазу в новую пробирку, добавляли 150 мкл фенола и 150 мкл хлороформа (24:1 изоамиловый спирт), тщательно перемешивали и центрифугировали при 13 000 об/мин 5 мин, отбирали верхнюю фазу, добавляли 300 мкл хлороформа, центрифугировали. Верхнюю водную фазу переносили в чистую пробирку, добавляли 120 мкл 10 М ацетата аммония и 500 мкл изопропанола, тщательно перемешивали. Инкубировали в течение ночи при температуре -20°С. Осадок промывали дважды 250 мкл 70% этанола, центрифугировали, подсушивали осадок и растворяли в 50 мкл ТЕ
|
|
|
Друг
Выделение ДНК из тканей животных
Данный метод используется для выделения высокомолекулярной ДНК. В основе метода лежит лизис клеток SDS (додецилсульфат натрия, входит в состав многих бытовых моющих средств и зубной пасты), депротеинизация фенолом и хлороформом и осаждение ДНК спиртом.
|
|
|
Внимание! Фенол является ядовитым веществом, оставляющим ожоги на коже. Хлороформ – сильный канцероген, может вызывать нарушения работы центральной нервной системы. Работать необходимо в хорошо проветриваемом помещении под вытяжкой.
Необходимые реагенты:
STE-буфер: 0,1М NaCl; 0,1М Tris-HCl (рН 7,5); 0,001M ЭДТА, стерилизовать автоклавированием (20 мин. при 121°С).
PCl: смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт в пропорции 25:24:1. Фенол предварительно перегнать под воду и довести рН до 7,1-7,5 добавлением ТЕ-буфера
Cl: смесь хлороформ-изоамиловый спирт в пропорции 24:1.
ТЕ-буфер: 0,001М Tris-HCl (рН 7,5); 0,001M ЭДТА
Предварительно растереть ткань в жидком азоте в фарфоровой ступке.
1. Перенести 100 мг пробы в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку (Eppendorf), прилить 500 мкл STE-буфера.
2. Добавить 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл рабочего раствора) и 25 мкл SDS (20% водный раствор), ресуспендировать пробу.
3. Инкубировать 1-2 часа при 55°С, периодически переворачивать пробирку для перемешивания пробы.
4. Добавить 500 мкл PCl, перемешивать до образования однородной эмульсии (не допускается энергичное встряхивание во избежание механического разрушения ДНК).
|
|
|
5. Центрифугировать 5 мин при 7000 g.
6. Верхнюю фазу перенести в чистую 1,5 мл пробирку, стараясь не захватывать интерфазу.
7. Повторить ПП. 4-6.
8. Добавить 500 мкл Cl, перемешивать до образования однородной эмульсии (не допускается энергичное встряхивание во избежание механического разрушения ДНК).
9. Центрифугировать 3 мин при 7000 g.
10. Верхнюю фазу перенести в чистую 1,5 мл пробирку, стараясь не захватывать интерфазу.
11. Повторить ПП. 8-10.
12. Добавить 45 мкл 2М NaCl или 3M NaAc и 1 мл 96% этанола, премешать переворачивая пробирку.
13. Инкубировать в морозильной камере при -16 (-20)°С 10-20 минут.
14. Центрифугировать 1-2 мин при 7000 g, супернатант удалить.
15. Просушить осадок от спирта в вакуумной центрифуге или при комнатной температуре (открыв крышку пробирки) до исчезновения запаха спирта (примерно 20 мин.).
16. Растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды или ТЕ-буфера.
другое
При выделении ДНК из тканей растений важным фактором является эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических разрывов в цепи!). Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и еѐ количественным выходом, ведь молекулы ДНК – самые крупные полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из клеток – это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания двухвалентных катионов. От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. После депротеинизации препарат всѐ ещѐ сильно загрязнѐн полисахаридами. 12 Если требуется большое количество чистой ДНК, то образцы очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (cetyl trimethyl aммonium bromid) и SDS (sodium dodecyl sulfate). Метод с использованием СTAB (Rogers, Bendich, 1985) позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со CTAB. При снижении концентрации соли ниже 0,4М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов CTAB/нуклеиновая кислота, тогда как большая часть полисахаридов остается в растворе. Осадок снова растворяют в высокосолевом растворе 1М NaCl и высаживают ДНК спиртом. Другая методика также предусматривает использование детергентов, в частности SDS, который также осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов (при этом инактивируются нуклеазы). Ниже приведена модификация одного из таких методов, изначально разработанного Делапорта с соавт. (Dellaporta et al., 1985). Белки и полисахариды в растительных экстрактах при 0 С образуют комплексы с SDS и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Высокомолекулярная ДНК, очищенная впоследствии от белков фенолом, осаждѐнная спиртом и растворѐнная в соответствующих буферах пригодна для рестрикции и ПЦР.
Дата добавления: 2019-02-22; просмотров: 155; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!