Факторы, влияющие на скорость деления клеток
1) специфические (фибробласты реагируют на фактор роста фибробластов). Используют специфические в-ва, которые влияют только на определенный вид клеток.
2) неспецифические (гормоны и их аналоги – инсулин, гидрокортизон, дексаметазон, эстрадиол, тестостерон). Эти факторы вызывают деление любых клеток.
Способы культивирования клеток животных
В зависимости от соотношения с поддерживающим выделяют монослойные и суспензионные культуры. Монослойная культура субстрат-зависимая и клетки могут расти только до закрытия поверхности и если поверхности нет, то клетки не растут.
В зависимости от способа пересева выделяют проточные и непроточные.
Для непроточных культур характерно введение клеток в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных в-в и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. Культивируют в матрацах (плоские сосуды), во вращающихся колоннах, в колоннах на микроносителях (стеклянные бусы, микропластины). В качестве носителей используют алюмоборосиликатное стекло, не содержащее ионов натрия, подщелащивающих среду; пластик из полистирола, поликарбоната, поливинилхлорида, тефлона; металлические пластинки из нержавеющей стали и титана.
В проточной культуре происходит постоянное продвижение (поступление и выведение) жидкой среды. Обеспечиваются истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных в-в и метаболитов, а также числа клеток. Выделяют суспензионные и монослойные (на микроносителях) культуры.
|
|
|
Тест «Бактериальные эндотоксины». Гель-тромб метод.
ИБЭ проводят для опред. наличия или количества эндотоксинов, источником к-рых явл. Грамм- бактерии, с исп. лизата амебоцитов мечехвоста. Способы проведения исп-ния: способ гель-тромба, основанный на обр. геля; турбидиметрический способ, основанный на помутнении в результате расщепления эндогенного субстрата; хромогенный способ, основанный на появлении окраски после расщепления синтетического пептидно-хромогенного комплекса.
Гель-тромб метод. Способ гель-тромба основ. на свертывании лизата в присутствии эндотоксинов. Мин. Конц. эндотоксинов, треб. для свертывания лизата в стан. Усл., представляет собой указанную на этикетке чувствительность лизата.
Перед началом исслед. проводят предвар. испытания на подтверждение заявленной чувствительности лизата и определяют мешающие факторы. Мешающие факторы удаляют путем фильтрации, нейтрализации, диализа или теплового воздействия.
|
|
|
Предельный метод. Смешивают р-р лизата и р-р стандарта эндотоксинов / испытуемый раствор. Реакционную смесь инкубируют обычно при t 37±1ºС в течение 60±2 мин, избегая вибрации. В присутствии р-ра стандарта эндотоксина должно происходить свертывание лизата (полож. контроль). Испытуемый р-р в нулевой конц. эндотоксина не должен сворачиваться. Одновременно проверяют прочность геля путем поворота пробирок на 180 º. Гель должен оставаться на своем месте.
Количественное определение. Определяют количество эндотоксинов путем титрования до конечной точки. Готовят разведения станд. Р-ра и испытуемого ра-ра. За конечную точку принимают мин. Конц. в нисходящем ряду конц. эндотоксина, приводящую к свертыванию лизата. Для определения конц. эндотоксинов в исп. Р-ре находят конц. в конечной точке путем умножения каждогo фактора разведения в конечной точке на λ.
Билет
Питательные среды и материал для культивирования животных клеток и клеток человека.
Культивируют элементы соединительной ткани человека (фибробласты); скелетные ткани (кость и хрящи); скелетные, сердечные и гладкие мышцы; эпителиальные ткани; ткани печени, легких, почек; клетки нервной системы; эндокринные клетки (надрочечников, гипофиза, клетки островков Лангерганса); меланоциты и различные опухолевые клетки.
|
|
|
Также культивируют клетки почки обезьяны, почки собаки, почки кролика, куриные эмбрионы (в течение 14 дней), клетки легких эмбриона человека (16 недель).
Клетки после извлечения их из ткани или организма помещают в культуральную среду,которая должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Питательная среда представляет собой р-р определенного состава, к которому добавляются компоненты биологического происхождения. Ключевым компонентом может являться сыворотка животных, например, эмбриональная бычья (телячья). Без такой добавки наибольшая часть культивируемых клеток не будет воспроизводить собственную ДНК и не будет пролиферировать. Также к таким добавкам относят: белки, незаменимые аминокислоты, незаменимые жирные кислоты, витамины, источники углерода, предшественники простагландинов. Добавляют минеральные компоненты (натрия, калия и кальция хлориды, микроэлементы (железо, медь, кобальт, цинк, селен)).
Жидкие питательные среды, как правило, готовят на основе солевых р-ров Эрла и Хенкса. Основные требования к питательным средам: стерильность; определенное осмотическое давление; определенное рН (регулируют добавлением буферных р-ров).
|
|
|
Осмотическое давление выражают в осмотической концентрации – концентрации всех р-ренных частиц. Может выражаться как осмолярность (осмоль на л р-ра) и как осмоляльность (осмоль на кг р-рителя). Осмоль – единица осмотической концентрации, равная осмолярности, получаемой при р-рении в одном литре р-рителя одного моля неэлектролита. Осмолярность (Osm) электролита зависит от его концентрации, коэффициента диссоциации и числа ионов, на которые он диссоциирует:
Osm=nФС
где Φ – коэффициент диссоциации, от 0 (для неэлектролита) до 1 (полная диссоциация), n - количество ионов, на которые диссоциирует,C – молярная концентрация.
1) среда Игла:минеральные в-ва, 13 незаменимых аминокислот, 5 водор-римых витаминов, холин, инозит. Основа – р-р Эрла. Используют только с эмбриональной телячьей сывороткой.
2) среда Дульбенко – основа для бессывороточных сред. Содержит двойную концентрацию аминокислот, глицерин, серин, пируват и железо. Используют для различных типов клеток.
3) среда Искова – модифицированная среда Дульбенко. Содержит дополнительно витамин В12, селенит натрия, 4-(2-оксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту. Кислота имеет буферные свойства. В cреде снижена концентрация натрия хлорида и натрия гидрокарбоната. Используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.
4) среда МакКоя 5А – модифицированная среда Ивката и Грейса. Используется для культивирования лимфоцитов в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки.
5) среда 199 для поддержания перевиваемых культур.
Дата добавления: 2018-04-04; просмотров: 766; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!