Определение количества хлоридов в слюне титрационным аргентометрическим осадочным методом Левинсона
Принцип метода
Ионы Ag+ способны к образованию нерастворимых солей с ионами Cl–. Титрование хлорид-ионов азотнокислым серебром проводят в присутствии индикатора К2СrO4. Количество осаждающего вещества (AgNO3) эквивалентно содержанию ионов Cl–, и при достижении эквивалентной точки титрования избыток ионов Ag+ образует с индикатором соединение кирпично-красного цвета (Ag2CrО4).
Проведение анализа
Для осаждения белков слюны в двух пробирках готовят смесь из 5 мл 0,45 % раствора ZnSO4 и 1 мл 0,1 М раствора NaOH. Затем в 1-ю пробирку (опыт) вносят 0,1 мл слюны, во 2-ю (контроль) ‑ 0,1 мл дистиллированной воды. Пробирки кипятят в течение 3 минут над пламенем спиртовки. Затем содержимое пробирок фильтруют через воронки с ватным фильтром в колбочки для титрования. Осадок на ватном фильтре промывают два раза водой (по 3 мл). К фильтрату приливают 2 капли 2 % раствора К2СrO4 и для осаждения ионов хлора титруют раствором AgNO3 до изменения жёлтого цвета раствора на кирпично-красный.
Расчёт
Содержание хлоридов в слюне в мг% рассчитывают по формуле
С (мг%) = (Vопыт – Vконтр) · 0,355 · 1000 ,
где: Vопыт – объём AgNO3, израсходованный на титрование опытного раствора; Vконтр – объём AgNO3, пошедший на титрование контрольного раствора; 0,355 – коэффициент для пересчёта результата в мг хлора на 0,1 мл слюны; 1000 ‑ коэффициент для пересчёта содержания хлора в мг на 100 мл (мг%).
Для пересчёта показателя хлоридов из мг% в ммоль/л (единицы СИ) используют коэффициент 0,282
|
|
С (ммоль/л) = С (мг%) · 0,282
Нормальные величины
Ротовая жидкость 20–40 ммоль/л.
Практическое значение
Ионы Cl– участвуют в поддержании заряда мицелл и коллоидоустойчивости слюны. Избыток хлорид‑ионов снижает коллоидную устойчивость ротовой жидкости и минерализующую способность мицелл в отношении зубной эмали.
Определение содержания хлоридов в плазме крови колориметрическим методом
Принцип метода
Хлорид-ионы освобождают из хлораниловокислой ртути (II) хлораниловую кислоту, содержание которой определяется фотометрически, количество хлораниловой кислоты пропорционально концентрации хлорид-ионов в пробе.
Проведение анализа
Опыт, мкл | Контроль, мл | |
Плазма крови Стандартный раствор NaCl Раствор хлораниловокислой ртути | 20 ‑ 2000 | ‑ 20 2000 |
1 мин энергично встряхивают и инкубируют 10 минут | ||
Эфир | 2 капли | 2 капли |
Перемешивают пробы и фильтруют через смоченные водой фильтры | ||
Колориметрируют обе пробы против воды при длине волны 530 нм (зелёный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм. |
Расчёт
Количество хлорид-ионов в плазме крови рассчитывают по формуле
|
|
Содержание хлоридов [ммоль/л] = ,
где: ЕОП и ЕСТ ‑ оптическая плотность опытной и стандартной проб,
ССТ ‑ концентрация хлоридов в стандартном растворе (100 ммоль/л).
Нормальные величины
Плазма крови 94‑110 ммоль/л
Рассчитывают процентное соотношение концентрации хлорид ионов (К) в ротовой жидкости и концентрации хлорид-ионов в плазме крови.
К (%) = (СРЖ / СПЛ) · 100 % ,
где: СРЖ ‑ концентрации хлоридов в ротовой жидкости (моль/л),
СПЛ ‑ концентрация хлоридов в плазме крови (ммоль/л).
Практическое значение
Ионы Сl– являются основными внеклеточными анионами, присутствуют во всех жидкостях организма. Гиперхлоремия наблюдается при обезвоживании, вызванном недостаточным поступлением жидкости, при повышенном поступлении хлорида натрия, декомпенсации сердца, метаболическом ацидозе и респираторном алкалозе, снижении экскреции хлорид-ионов с мочой при нефритах, отравлении салицилатами, приёме глюкокортикоидов. Гипохлоремия встречается чаще и возникает при недостаточном поступлении хлоридов и избыточной потере через желудочно-кишечный тракт при заболеваниях, сопровождающихся неукротимой рвотой и поносом, при стенозе привратника, длительном потоотделении, почечном и сахарном диабете, сморщенной почке, в результате перераспределения и задержки хлоридов в повреждённых тканях при хронических воспалительных процессах, абсцессах, некрозах.
|
|
Оформление работы
Указывают принцип метода, регистрируют данные, делают расчёты, сравнивают полученные результаты с нормальными значениями показателя хлоридов в ротовой жидкости и плазме крови, делают выводы о наличии/отсутствии отклонений.
Задание
Провести сравнительную оценку полученных на лабораторных работах показателей содержания хлоридов, фосфатов, ионов кальция в крови с аналогичными показателями в слюне с целью охарактеризовать влияние минерального обмена организма на минеральный обмен в слюне. Предположить и обосновать пути и возможности гормональной регуляции минерального обмена слюны.
Лабораторная работа 5.
Обнаружение роданидов в ротовой жидкости
В ротовой жидкости содержатся роданиды (тиоцианаты), которые являются продуктом сульфирования цианидов (солей синильной кислоты) тиосульфатом натрия с помощью фермента роданазы:
КСN + Na2S2O3 Na2SO3 + KSCN
Роданиды активируют пероксидазы слюны, участвующие в метаболизме пероксидов, и тем самым оказывать защитное действие. В гранулоцитах, поступающих в полость рта с жидкостью десневой борозды, локализован фермент лактопероксидаза, который окисляет имеющийся в слюне роданид с помощью перекиси водорода в бактерицидный гипотиоционат:
|
|
SCN– + H2O2 OSCN– + H2O
Содержание роданидов в слюне зависит от контакта человека с табачным дымом. В слюне курильщиков их концентрация значительно больше по сравнению с таковой у некурящих. Высокие концентрации роданидов в ротовой жидкости вызывают токсические эффекты в пародонте.
Принцип метода
Роданиды в слюне обнаруживают по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хлорного железа. Реакция обусловлена образованием роданистой соли трехвалентного железа в результате взаимодействия ионов Fe3+ и SCN– и образованием различных комплексов, имеющих состав от Fe(H2O)5(NCS)2+ до Fe(NCS)63–. Некоторые органические соединения (например, соли лимонной и уксусной кислот) препятствуют образованию окраски.
Необходимые реактивы
1) 0,01 % раствор хлорного железа, 2) 2 % раствор соляной кислоты.
Материал для исследования
Слюна некурящего человека и курильщика.
Проведение анализа
Готовят две пробы: опытную (слюна курильщика) и контрольную (слюна некурящего человека). В каждую пробирку к 10 каплям слюны добавляют по 2 капли 2 % раствора соляной кислоты и по 2 капли раствора хлорного железа (FeCl3). В результате появления роданида железа развивается красное окрашивание разной интенсивности в зависимости от концентрации ионов роданида.
Нормальные величины
Ротовая жидкость 0,5‑1,2 ммоль/л
(визуально окраска не дифференцируется).
Практическое значение
Основным путём поступления лейкоцитов в полость рта является десневая бороздка и её жидкость. В местах повреждения слизистой оболочки полости рта происходит дополнительная эмиграция гранулоцитов из крови, которые принимают участие в защитных реакциях. Один из механизмов защиты основан на способности гранулоцитов к продукции гипотиоцианата. Гипотиоционат чрезвычайно бактерициден и совместно с пероксидом водорода и другими активными формами кислорода действует на микрофлору в полости рта (в том числе кариесогенную). Однако высокие концентрации роданидов оказывают токсическое влияние на пародонт, способствуя развитию воспалительных процессов.
Содержание роданидов (тиоцианатов) достаточно велико в слюне курильщиков (в 2‑10 раз выше, чем у некурящих людей), что связано с поступлением в их организм синильной кислоты, содержащейся в табачном дыме. Чем выше концентрация тиоцианатов в слюне, тем более заметной становится окраска.
Оформление работы
Указывают принцип метода, фиксируют результаты, сравнивают полученные у разных людей данные с нормальными величинами, делают вывод о наличии/отсутствии патологических отклонений и значении показателя.
Лабораторная работа 6.
Определение активности a–амилазы в слюне, плазме крови и моче
a-Амилаза (диастаза, 1,4–a–D–глюкангидролаза, КФ 3.2.1.1) катализирует гидролиз a–1,4–гликозидных связей крахмала до декстринов и мальтозы:
Крахмал + Н2О мальтоза + декстрины
a‑Амилаза тканеспецифична, её продуцируют слюнные железы и поджелудочная железа. Главная роль a‑амилазы в организме ‑ пищеварительная, поэтому фермент секретируется экзокринно, поступая, соответственно, в ротовую полость и просвет 12-пёрстной кишки. До 70 % фермента в полость рта секретируют околоушные железы. В результате естественного старения и отмирания клеток слюнных и поджелужочной желёз молекулы фермента попадают в кровь, поэтому в плазме крови всегда в небольшом количестве содержится a‑амилаза двух изоферментных типов: слюнной S‑тип (около 70 %) и панкреатический P‑тип (около 30 %). Фермент имеет относительно низкую молекулярную массу (около 48000 D), в связи с чем фильтруется в почечных клубочках и присутствует в моче. Соотношение изоферментов в моче иное, чем в крови: Р‑тип – 70 %, S‑тип – до 30 %. Хлориды и иодиды повышают активность фермента. При нарушении целостности железистых клеток, вырабатывающих a‑амилазу, процессам цитолиза сопутствует повышение концентрации и активности фермента в плазме крови и моче, что используют с целью диагностики заболеваний слюнных и поджелудочной желёз. В моче этот фермент традиционно называют «диастаза».
Энзиматический кинетический метод,
оптимизированный для биологических жидкостей
Принцип метода
a‑Амилаза катализирует реакцию гидролитического преобразования специфического углеводного субстрата, протекающую с отщеплением от олигосахарида 2‑хлор‑4‑нитрофенола:
2‑Cl‑4‑нитрофенил‑олигоCAX + Н2О → 2‑Cl‑4‑нитрофенол + олигоCAX
Скорость образования 2‑хлор‑4‑нитрофенола пропорциональна активности фермента и определяется фотометрически.
Необходимые реактивы
Стандартный набор: 1) буферный раствор (0,05 М MFS‑буфер (pH 6,0) и 5 ммоль/л раствор хлористого кальция), 2) лиофилизированный субстрат. Для приготовления рабочего реагента, содержащего субстрат в концентрации 2,5 ммоль/л, содержимое флакона с субстратом растворяют в буфере при аккуратном перемешивании и оставляют на 3‑5 минут для стабилизации.
Материал для исследования
1) Ротовая жидкость (разведение 10‑50 раз), 2) сыворотка крови, 3) моча.
Проведение анализа
В кювете фотометра с длиной оптического пути 1 см смешивают рабочий реагент и исследуемую жидкость в соотношении 50:1 (рекомендуется использовать 3,5 мл рабочего реагента и 70 мкл сыворотки крови или разведённой слюны) и через 10 секунд измеряют оптическую плотность раствора (Е0) при длине волны 405 нм против воздуха. Измерение повторяют точно (по секундомеру) через 1 мин (Е1), 2 мин (Е2), 3 мин (Е3), не вынимая кювету из прибора.
Расчёт
Считают среднее значение изменения оптической плотности в минуту ΔЕ/мин.
ΔЕ/мин = [(Е1 ‑ Е0) + (Е2 ‑ Е1) + (Е3 ‑ Е2)] : 3
Расчёт активности a‑амилазы производят по одной из формул (в зависимости от того, в каких единицах необходимо представить активность фермента):
Активность a‑амилазы [Ед/л] = ΔЕ/мин · 3806
Активность a‑амилазы [нмоль/(с · л)] = ΔЕ/мин · 63446
Нормальные величины
Значения активности a‑амилазы в сыворотке зависят от температуры анализа:
при 25 °С ‑ до 120 Ед/л или до 2000 нмоль/(с · л)
при 30 °С ‑ до 160 Ед/л или до 2670 нмоль/(с · л)
при 37 °С ‑ до 220 Ед/л или до 3670 нмоль/(с · л)
Дата добавления: 2020-04-25; просмотров: 161; Мы поможем в написании вашей работы! |
Мы поможем в написании ваших работ!