МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Подобная структурная организация 8 ОРС: трипликация генов CG32500, CG32819 и однонаправленность транскрипции может быть связана с перемещением мобильных генетических элементов. Транспозиции, приведшие к образованию кластера D. melanogaster, можно проследить при сравнительном анализе генов, гомологичных генам DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, у разных видов Drosophila. Исследования проводились с помощью биоинформатического анализа секвенированных геномов видов дрозофилы, находящихся в разной степени филогенетического родства. Последовательности геномов разных видов Drosophila секвенированы в конце 2007 года и размещены в базе данных FlyBase, но они еще не аннотированы.

Гомологи исследуемых генов кластера обнаружены в геномах всех исследованных видов.

На основании проведенного биоинформатического анализа построена схема эволюции кластера генов района flamenco (Рис. 5). Таким образом, гомологи генов кластера района гена flamenco присутствуют в геномах всех анализируемых видов, но ни в одном из них, структурная организация района не повторяет строение кластера у D. melanogaster.

Ген DIP1 консервативен у всех видов, причем у D. sechellia и D. simulans он существует в нескольких структурных вариантах. Таким образом, функция гена DIP1 является консервативной в разных видах дрозофилы.

Рис. 5. Эволюция кластера генов района гена flamenco. Показаны гомологи генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476. Горизонтальными стрелками – возможные этапы сборки генов в кластер. В круг обведены гены, которые повторены 3 раза у D. melanogaster.

Поиск РНК-предшественника piРНК в области локализации гена flamenco

В области гена flamenco считывается значительное количество piРНК, участвующих в подавлении транспозиций МГЭ. Была выдвинута гипотеза, что в этой области транскрибируется длинная молекула-предшественник с антисмысловой цепи гена DIP1, дающая начало piРНК (Brennecke et al., 2007). Область локализации ближайшей к гену DIP1 piРНК картирована на расстоянии ~2500 п.н. от начала гена (Рис. 6).

Если предположить, что в линиях с фенотипом flamenco⁺ образуется единый однонитевой РНК-предшественник piРНК, который в результате процессинга дает начало множеству piРНК, то, очевидно, в линиях с фенотипом flamenco механизм образования коротких молекул РНК нарушен.

Причин нарушения может быть как минимум две: цельный транскрипт или не образуется в результате нарушения инициации транскрипции, или образуется, но не подвергается дальнейшему процессингу. Поиск единого РНК-предшественника piРНК был проведен методом ОТ-ПЦР с подобранными специфическими праймерами на РНК, выделенной из яичников линий flamenco⁺, MS, SS, Oregon R (+Y⁺³). Область исследования, праймеры и размер продуктов указаны на рис. 6.

Анализ ПЦР-продуктов на матрице кДНК подтвердил гипотезу о существовании в исследуемой области продуктов транскрипции. Продукты обнаруживаются как в районе между началом гена DIP1 и первой piРНК, так и внутри гена DIP1. Уровень экспрессии в линиях с фенотипом flamenco снижен по сравнению с уровнем flamenco⁺ линии (данные не приведены).

Рис. 6. Схема расположения праймеров в области гена flamenco.Фигурными скобками показаны амплифицированные фрагментов кДНК, указаны их размеры. Обозначен HB внутри второго интрона гена DIP1 и его предполагаемый промотор (Потапова и др., 2009). Обозначена предполагаемая молекула-предшественник. Треугольником обозначена инсерция (~1,5 т.п.н. от начала гена DIP1), приводящая к фенотипу flamenco. Пунктиром показано положение центромеры относительно района гена flamenco. Вертикальными пронумерованными линиями обозначены точки для анализа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Таким образом, общий уровень экспрессии области flamenco в линиях SS и Oregon R (+Y⁺³) ниже, чем в flamenco⁺, что может быть связано со структурными особенностями линий: наличие вставки во втором интроне гена DIP1 в линиях SS и Oregon R (+Y⁺³) и увеличение области начала гена DIP1 в линии Oregon R (+Y⁺³) на 173 п.н.

Мы предположили, что молекула РНК-предшественника piРНК может транскрибироваться с промотора МГЭ НВ, локализованного в составе гена DIP1. Этому способствует направление транскрипции МГЭ НВ противоположное транскрипции гена DIP1 (Рис. 6). Биоинформатическим методом определена область предполагаемого промотора в элементе HB (Рис. 7Б), кроме промотора на комплементарной цепи гена DIP1 выявлены и другие промоторы (Рис. 7Б).

Б А

Рис. 7. Поиск области предполагаемого промотора в последовательности HB. А. Схема локализации праймеров в гене DIP1. Отмечена предполагаемая область промотора, показан размер HB элемента. Штрих-линией обозначены продолжения гена DIP1. Б. Диаграмма с обнаруженными биоинформатически промоторами. По оси Y отложена вероятность нахождения промотора, по оси Х протяжённость DIP1 и прилегающей области в п.н. В круг обведены наиболее вероятные промоторные последовательности.

Для установления предполагаемой области начала транскрипции были подобраны несколько праймеров до и после предполагаемой точки начала транскрипции (Рис. 7А).В качестве матрицы для постановки ОТ со специфическим праймером RT1 for1 использовали РНК линий flamenco⁺, MS и Oregon R (+Y⁺³), выделенную из яичников.

Среди продуктов амплификации выявлены фрагменты нужной длины (соответствуют длине фрагментов, представленных в базе данных) с парами праймеров RT1 for1-RT1 rev1 и RT1 for1-RT1 rev2 (Рис. 7А). ПЦР-продукт с парой праймеров RT1 for1-RT1 rev3 обнаружен не был, что свидетельствует об отсутствии РНК-матрицы в конце второго интрона гена DIP1, левее предполагаемого промотора.

В то же время при наличии амплифицированного фрагмента с праймерами RT1 for1-RT1 rev2 можно утверждать о сдвиге области предполагаемого промотора. Тем более биоинформатический анализ показал возможность такого сдвига в район 3'-конца гена DIP1 (Рис. 7Б).

Таким образом, мы обнаружили, что молекула РНК-предшественника образуется как в линии flamenco, так и flamenco⁺, но обнаруженные ранее в линиях MS, SS и Oregon R (+Y⁺³) структурные изменения могут влиять на количество анализируемой матрицы.

Исследование области flamenco методом ПЦР в реальном времени

Намибыли подобраны пары праймеров в области flamenco (на рис. 6 вертикальными пронумерованными линиями показаны анализируемые точки). Для постановки ОТ в качестве затравок использовали 6 пар праймеров, которые отжигались одновременно на одной и той же матрице РНК, выделенной из яичников или семенников. Это позволяло оценить уровень транскрипции РНК исследуемых линий с фенотипом flamenco⁺ и flamenco по шести точкам. После серии аналогичных экспериментов данные были объедены и обработаны программой Bio-Rad CFX Manager (Рис. 8). Представлены диаграмма и график, соответственно, экспрессии в яичниках по семи анализируемым точкам в линиях flamenco⁺, MS и Oregon R (+Y⁺³). Линию SS в данных экспериментах не использовали.

Из диаграммы на (Рис. 8) видно, что в линии с фенотипом flamenco⁺ экспрессия в районе локализации гена flamenco в целом выше, чем в линии MS и Oregon R (+Y⁺³), особенно, в точках между началом гена DIP1 и началом скопления МГЭ. Скорее всего, это связано со структурными отличиями линий с фенотипом flamenco: наличие вставки в районе HB (линии MS, SS и Oregon R (+Y⁺³)), вставка в область начала гена DIP1 (линия Oregon R (+Y⁺³)). Область между геном DIP1 и первой обнаруженной piРНК, видимо, является регуляторной, поэтому в линии flamenco⁺, где не нарушена регуляции транспозиции МГЭ, она экспрессируется с большей эффективность и далее происходит снижение экспрессии за счет процессинга однонитевого транскрипта. Причем процессинг начинается только в районе скопления МГЭ, а в районе возможной регуляции остается на высоком уровне.

Рис. 8. Диаграмма экспрессии 6 анализируемых точек в районе локализации гена flamenco в линиях flamenco⁺, MS и Oregon R (+Y⁺³) на РНК, выделенной из яичников. Суммарные данные 7 независимых экспериментов нормализованы относительно референсного гена rp49. Показан доверительный интервал значений. Последовательность столбцов соответствует последовательности точек в области локализации гена flamenco.

В линии MS снижена экспрессия исследованного района (Рис. 8, 9). Резкое уменьшение количества РНК-предшественника выявляется во втором интроне гена DIP, что связано с наличием вставки в HB. Далее РНК обнаруживается во всех исследуемых точках, в том числе в области скопления дефектных копий МГЭ. Стабильное количество РНК в точках 4-6 (Рис. 9) свидетельствует о нарушении функции процессинга РНК-предшественника. Таким образом, вставка IdSS влияет на уровень экспрессии, но не на процесс образования piРНК. Процессинг может быть нарушен в следствие мутаций в генах, кодирующих белки, которые участвуют в биогенезе коротких молекул РНК (Pélisson et al., 2007).

Как и в линии MS, в линии Oregon R (+Y⁺³) наблюдается стабильный сниженный уровень экспрессии РНК. Снижение экспрессии выявлено только в области HB. Не исключено, что вставка внутри гена DIP1 влияет только на количество образованного транскрипта. Следующая же вставка (в начале гена DIP1) компенсирует эффект снижения и приводит к восстановлению уровня активного транскрипта. В результате, полноценная молекула РНК-предшественника подвергается процессингу. В данном случае фенотип flamenco не является следствием структурных изменений и обусловлен наличием другого, отличного от линии MS, аллеля flamenco. По-видимому, фенотип flamenco в линии Oregon R (+Y⁺³) обусловлен сниженным количеством piРНК, связанным с уменьшенным количеством РНК-предшественникаАналогичным образом по 5 точкам был исследован район локализации гена flamenco на РНК, выделенной из семенников. Анализируя данные, можно сделать вывод, что экспрессия в данном районе не проявляет никаких закономерностей.

Рис. 9. РНК-предшественник в яичниках линии flamenco+, MS и Oregon R (+Y+3). Порядок и название точек соответствует порядку на рис. 7 и 8.

По-видимому, РНК района локализации гена flamenco не принимает участие в сперматогенезе, в отличие от самок, для которых было доказано участие данного локуса в гаметогенезе(Brennecke et al., 2007).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Процессы посттранскрипционного подавления экспрессии генов выполняют в организме функцию, направленную на репрессию чужеродных последовательностей ДНК- и РНК-содержащих вирусов и мобильных элементов. Эти механизмы являются очень эффективными в распознавании новых элементов, поскольку не зависят от конкретной структуры, особенностей размножения или кодируемых белков чужеродных последовательностей. Они обеспечивают подобие иммунной системы на уровне последовательностей нуклеиновых кислот, а не белков, при этом, в отличие от иммунной системы, образование фактора, специфически противостоящего заражению конкретным элементом, происходит в момент инфекции и не требует предварительных стадий.

Производимые в районе локализации гена flamenco piРНК участвуют в контроле транспозиции в половых клетках яичников у D. melanogaster. Причем, в каких именно, герминальных или фолликулярных, соматического происхождении, остается неизвестным. Важно отметить, что piРНК данного района взаимодействуют с белком Piwi. И путь образования piРНК с участием Piwi относят к механизму образования первичного класса piРНК. Первичные piРНК инициирует образование вторичных piРНК, амплификация которых выступает как мгновенный и эффективный путь защиты от действия атакующих постоянно геном МГЭ. Процесс амплификации особенно важен при гаметогенезе у самок. Ведь при активной транспозиции МГЭ необходимо обеспечить потомству подобие «иммунной» системы.

Полученные в работе данные однозначно свидетельствуют о наличии молекулы РНК-предшественника piРНК в линиях c фенотипами flamenco и flamenco⁺, что позволяет выдвинуть следующую гипотезу. С каждого промотора независимо синтезируются РНК различного (небольшого) размера, соответственно их концы могут также являться затравками для транскрипции, и происходит накопление транскрипта в линии flamenco⁺ (то есть в норме). Напротив, в линии MS, где наблюдается генетическая нестабильность, экспрессия снижена по сравнению с диким типом и вставка IdSS, изменяя последовательность, затормаживает цепную реакцию образования РНК. В линии Oregon R (+Y⁺³) наблюдается снижение эффективности транскрипции, как и в MS, при этом процессинг РНК-предшественника происходит. Следовательно, в этом случае включаются неизвестные механизмы восстановления синтеза РНК с последующим нарезанием на piРНК.

ВЫВОДЫ

1. Во втором интроне гена DIP1 у D. melanogaster обнаружен дефектный мобильный генетический элемент HB. В линиях с фенотипом flamenco внутри HB выявлена инсерция (IdSS) размером 182 п.н. Изучение экспрессии гена DIP1 в линиях D. melanogaster с разным статусом flamencoпоказало, что эта инсерция не только влияет на экспрессию гена DIР1, но и участвует в формировании фенотипа flamenco.

2. В линии дрозофилы Oregon R (+Y⁺³) с фенотипом flamenco в промоторной области гена DIP1 обнаружена вставка размером 173 п.н. Анализ экспрессии гена DIP1 в линиях D. melanogaster, отличающихся по статусу flamenco, на разных стадиях развития показал, что в линии Oregon R (+Y⁺³) транскрипция этого гена происходит конститутивно, в отличие от всех других исследованных линий.

3. Показано, что ген DIP1 состоит из четырех экзонов, первый из них может быть представлен двумя альтернативными вариантами. Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 и его гомологов показал, что у D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana первый альтернативный экзон представлен только одним структурным вариантом. По-видимому, функционально значимым является лишь один из альтернативных вариантов первого экзона гена DIP1.

4. Показано, что гены CG32500, CG32819 и CG14476, локализованные рядом с геном DIP1 и образующие с ним единый кластер, в линиях flamenco и flamenco⁺ не участвуют в формировании фенотипа flamenco.

5. В линиях flamenco MSне формируются короткие РНК из протяженного транскрипта, синтезируемого в районе мастер-локуса flamenco. Показано, что транскрипция длинного РНК-предшественника молекул piРНК начинается с многочисленных промоторов, один из которых локализован во втором интроне гена DIP1.

6. Показано, что в генетически нестабильной линии MS и Oregon R (+Y⁺³) район локализации локуса flamenco экспрессируется менее интенсивно, чем в линии flamenco⁺. В линии MS кроме нарушения процесса образования piРНК имеются нарушения в процессах элонгации образования функционального транскрипта-предшественника piРНК.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-00693 и частичной поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2009-2011 г.г.).

Мы поможем в написании ваших работ!